专利名称：用于大致分离植物组织的方法和装备的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及植物繁殖和用于大致分离诸如胚胎的适用于遗传转化或组织培养的目标植物组织的机械的方法。
背景技术：
制备用于植物繁殖、再生和转化的组织费时且劳动密集，特别是因为其通常涉及手动分割可转化的或可培养的植物组织。例如，在玉米中(玉蜀黍(zea mays))，通常手动移除单独的不成熟的胚胎以提供可遗传转化的外植体。手动分割胚胎发生的组织费力并且存在对工人的人机工程学伤害的危险。另外，当需要较大量的可转化的植物组织用于高生产量转化和植物生产时，必须雇佣和培训更多工人以满足增加的需求。另外，根据单独的工人的技术水平、小心程度、注意力和疲劳程度，获得的植物组织的质量可能存在非常大的可变性。此组织可变性是有问题的，因为质量差的组织负面地影响随后的组织培养、遗传转化和植物繁殖的效率。从而，在本领域中需要更加迅速地，减小工人的总的人体工程学负担，减小处理植物材料所需要的工人的量，和/或出产比手动生产的组织质量更高或更一致的植物组织的制备目标植物组织的方法。
发明内容
本发明披露了用于大致分离目标植物组织以用于植物组织培养和遗传转化的方法和装备，以简化、改进安全性、增加可靠性、减小人体工程学伤害、减小需要的人员的数量、和/或增加速度。特别是，本发明披露和要求适用于大致分离胚胎的方法和装备。在一些实施例中，该方法和设备可以用于大致分离诸如玉米胚胎的单子叶植物胚胎。大致分离的胚胎优选地适用于遗传转化或组织培养。这里披露的方法和装备特别适用于高生产量处理(即，大致分离大量目标组织和/或处理大量种子)。
本发明的一个方面包括用于从单子叶植物大致分离诸如胚胎的适用于遗传转化或组织培养的目标组织的方法。该方法包括(a)提供在果皮或种子的种皮内具有开口的包含不成熟的胚胎的单子叶植物种子；和(b)将足够大致从种子分离不成熟的胚胎的力施加到种子。在一些实施例中，从玉米种子大致分离不成熟的玉米胚胎。从而，获得的不成熟的胚胎优选地适用于遗传转化或组织培养。
本发明的另一个方面提供了用于大致分离诸如胚胎的适用于遗传转化或组织培养的目标植物组织的装备。该设备包括至少一个用于引导流体流的孔口。在一个实施例中，流体流接触玉米的穗上的谷粒并且导致胚胎变得大致从谷粒分离。大致分离的胚胎优选地适用于遗传转化或组织培养。
在一个实施例中，装备包括至少一个从以下部件中选择的部件(a)至少一个适用于将机械正压力施加到种子的外部的坚固的表面；(b)至少一个用于引导流体流的孔口；(c)至少一个用于施加负流体压力的孔口；和任何它们的组合。部件可以用于将足够大致分离诸如胚胎的目标组织的物理的力导向到种子上。从而，该装备可以用于从玉米的穗大致分离适用于遗传转化或组织培养的玉米胚胎。在一些实施例中，用于引导流体流的孔口导向流体流以接触玉米的穗上的玉米种子或谷粒。在一些实施例中，用于施加负流体压力的孔口导向负流体压力以接触玉米的穗上的玉米种子或谷粒。通过这样的装备大致分离的目标组织优选地适用于组织培养或遗传转化。
本发明还提供转基因植物、植物组织、和种子。转基因植物和植物组织可以通过以下步骤生产(a)使用这里描述的方法和/或装备大致分离目标组织，(b)将异种核酸分子引入目标组织以生产转化的外植体，和(c)在适合的生长条件下培养转化的外植体以生产转基因植物组织或植物。任何转化方法适用并且为本领域中的普通技术人员已知。另外，适合的培养和再生条件已知并且是常规的。转基因植物、植物组织、或种子优选为诸如玉米的单子叶植物。本发明还包括全部从转基因的植物组织或植物生产的后代植物、植物组织、和种子。
在接下来的详细描述中披露本发明的其它实施例。
图1示出了使用正机械压力来大致分离胚胎的本发明的装备的一个实施例，如在示例4中所描述的。
图2示出了通过本发明的方法使用流体射流正压力从种子取出胚胎的本发明的装备的一个实施例，如在示例7中所描述的。图例(A)可以在X、Y和Z维度运动的自动机，(B)旋转玉米穗的马达，(C)抓紧器，(D)保持玉米穗的把手，(E)防止材料向上飞溅的挡板，(F)防止材料向上飞溅的凸缘，(G)用于引导流体的孔口，(H)透明的管，(I)玉米穗，(J)摇动筛，(K)干酪包布或其它多孔材料，和(L)废物贮存器。
图3示出了玉米穗可以通过其被固定到自动机臂的使用磁性“把手”的安装机构的一个实施例，如在示例7中所描述的。
图4示出了适用于本发明的方法的喷嘴的一个实施例，如在示例7中所描述的。此喷嘴产生大致均匀的、扁平的片状流体射流。
图5示出了适用于本发明的方法的装备的一个实施例，如在示例13中所描述的。此设备包括用于产生大致扁平的流体射流的喷嘴和可选的吸头。图5(顶部)示出了这样的设备的一个实施例的截面图，示出了喷嘴、可选的吸头、和玉米穗可以如何相对于彼此定位。图5(底部)示意性地示出了定位在设备内的玉米穗。图例(A)基部，(B)保持器，(C)喷嘴，(D)吸头，(E)玉米穗，和(F)用于引导流体流的孔口。
图6示出了适用于本发明的方法的适用于施加负流体压力的部件的一个实施例，如在示例13中所详细描述的。图例(A)一个或多个用于引导流体流的孔口。
图7示出了图7A到7C，示出了使用力的组合并且适用于本发明的方法的设备的实施例的不同视图，如在示例13中所详细描述的。此设备包括具有能够将预先确定的量的机械压力施加到之前已经打开或截顶果皮的谷粒的基部的前缘的头，和用于施加负流体压力的部件。此装置还能够包括用于分配流体或引导流体流的装置。
图8示出了本发明的实施例，其中，筒的顶部全部地、部分地、或大致覆盖有稍微小于玉米穗的直径的膜或软的材料的片；和其接附到的把手。
图9示出了图8所示的实施例的替代的设计，其中，在膜内制造小的切口以提供附加的柔性。
图10示出了图8或9所示的实施例的侧视图，其中，提供用于将膜固定在装备上的装置。
图11示出了用于本发明的替代的膜接附系统。
图12示出了对来自McMaster-Carr#9010K12的超软性10A硬度硅树脂膜防溅罩(1/32英寸厚度)的测试。在膜内制造1”直径的孔。玉米芯能够向下通过开口运动并且也能够通过该开口返回。
图13示出了玉米芯，示出了胚胎在单独的谷粒内的位置。还示出了本发明的一个实施例，其中，将液体射流导向到谷粒的与胚胎定位的向顶的侧相反的向基的侧。
具体实施例方式
除非另外限定，当在本说明书的上下文中使用时，这里使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同的含意。当在本说明书和作为参考加入的材料的文字之间存在矛盾时，采用本说明书中提供的限定和意义。这里使用的名称和下面描述的制造或实验室程序对于本领域中的普通技术人员众所周知且普遍应用。
短语“大致分离”或“析取”指的是处理存在于较大的组织复合体(例如，种子)内或形成其的一部分的目标组织(例如，胚胎或其它组织外植体)，使得从较大的复合体的至少一半物理地分开目标组织。在一些实施例中，可以从较大的复合体的至少大约50％、60％、70％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或者其任何百分率物理地分开大致分离的目标组织。在其它实施例中，从较大的复合体的多于大约80％到大约100％、大约90％到大约100％、或大约99％到大约100％或之间的任何百分率物理地分开目标组织。在一些实施例中，可以从较大的复合体的大约100％物理地分开目标组织。
虽然从较大的复合体的一些百分比物理地分开大致分离的目标组织，不必要从该复合体纯化大致分离的目标组织。换句话说，大致分离的目标组织可以与较大的组织复合体保留在同一批内，只要从复合体物理地分开目标组织(如上所述)。然而，在一些实施例中，可能需要从大致分离的目标组织移除一些或全部分开的复合体。全部这样的实施例属于本发明的范围内。
短语“目标植物组织”指的是设法大致分离的植物组织或种子的部分。在本发明中，目标植物组织指的是能够被大致分离并且用于遗传转化或组织培养的植物或植物种子的任何部分。在一些实施例中，目标植物组织为胚胎，特别是来自诸如玉米的单子叶植物的不成熟的胚胎。
短语“适用于遗传转化”和“适用于组织培养”分别指的是有能力在适合的植物培养条件下转化或生长的植物组织。本领域中的普通技术人员能够通过使用常规的实验容易地确定特定的目标组织是否适用于遗传转化或组织培养。例如，可以在适合的植物介质(同样对于本领域中的普通技术人员已知)上培养来自一批大致分离的目标组织的样本，以确定该组织是否能够生长和再生。相似地，大致分离的目标组织的样本可以经历转化和筛选以确定是否存在异种核酸分子。这样的技术是常规的并且能够迅速地识别哪种组织有能力转化或组织培养并且识别哪种组织不可以，如果存在不可以的组织的话。
在术语以单数形式提供时，本发明人还考虑了通过该术语的复数形式描述的本发明的方面。
用于大致分离目标植物组织的方法本发明提供了大致分离适用于遗传转化或组织培养的目标植物组织的方法，包括(a)提供在果皮或种子的种皮内包含开口的种子；和(b)将足够大致从种子分离目标植物组织的力施加到种子。在一些实施例中，目标植物组织为胚胎。胚胎优选地为诸如来自玉米的单子叶植物胚胎。在一些实施例中，可以完全地或部分地分离大致分离的目标组织。例如，一批大致分离的不成熟的胚胎可以包括完整无缺的胚胎、部分的胚胎或它们的混合物。优选地，完整无缺的和/或部分的组织适用于遗传转化、组织繁殖、植物再生和其它组织培养应用。
当使用例如水流分离组织时，可以提供收集容器。在一些实施例中，为这样的收集器皿提供盖是有用的，以便改进装备的效率、减少混乱、防止来自射流的不合需要的飞溅、和/或限制任何析取的组织在收获期间逸出。可以使用任何适用的容器或容器盖。在本申请中在别处给出了示例并且对于本领域中的普通技术人员已知。
适用于容器的盖可以包括那些由金属、木头、玻璃、网、织物、塑料、橡胶、乳胶、丙烯酸树脂、和功能等价的材料制造的。在一些实施例中，材料是柔性的，以便在析取过程期间在维持穗附近的大致不透水密封的同时允许玉米的穗穿入和移除。材料可以提供有适合的开口以允许玉米的穗进入和移除。在一些实施例中，材料为坚固的并且包含用于在析取期间接收和保持穗的柔性的孔。在其它实施例中，材料是柔性的。这样的柔性的材料可以在容器上方伸展以形成液体不能透过的配合，但是允许通过穿入材料插入穗或通过提供开口以接收玉米的穗。在再一个实施例中，材料为具有柔性的开口的网或筛。
盖可以为可移除的或半永久地接附。在一些实施例中，通过弹性带或等价的固定装置保持材料。在其它实施例中，通过重量、摩擦圈环、钩、卡扣、或其它功能等价的固定装置将盖保持在适当的位置。
盖可以由柔性的材料制造并且具有不同的厚度。这些因素可以变化，以便获得插入和析取玉米的穗的希望的效果。接下来的表格示出了一些对于硅树脂盖的硬度和厚度参数。然而，本发明决不限于这些选择。
肖氏硬度膜厚度(英寸)10A 1/3210A 1/1620A 1/3220A 1/1640A 1/3240A 1/161.
在一个实施例中，收集容器覆盖有稍微小于玉米穗的直径的膜或软的材料的片和其接附到的把手。在替代的实施例中，在膜内制造小的切口以提供更大的柔性。图8-11提供了上述盖和接附装置的不同的实施例。
在一些实施例中，材料为耐高压的。耐高压的材料对于本领域中的普通技术人员众所周知。例如可以使用诸如软的硅树脂橡胶片的软的材料。本领域中的普通技术人员知道可以在提供减小析取的组织逸出并且防止不合需要的飞溅的收集器皿的同时允许析取的可能的材料和物理设置。
适用于植物组织培养和再生的程序在本领域中众所周知。例如，参看Adams等人的美国专利号5,550,318，Lundquist等人的美国专利号5,780,708，Duncan等人的美国专利申请
发明者W·亚当斯, B·达维斯, L·库彻尔, B·洛维, M·斯潘塞, M·T·曼 申请人:孟山都技术有限公司