专利名称：高活性植物抗冻蛋白及其分离技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗冻蛋白，特别是植物抗冻蛋白以及该植物抗冻蛋白的分离技术。
抗冻蛋白是一类能够降低冰点和减少冰晶生长速度的生物活性糖蛋白或蛋白质，是一种高效活性物质，在经济上存在着巨大应用价值，其应用范围包括以下几个方面1.生物材料低温保藏保护剂，保护细胞膜和细胞骨架的稳定性，降低冷害损伤，所以对各种细胞、精卵细胞、卵母细胞及其组织，器官，胚胎或整体动植物均具有一定的保护性，对器官移植等医学上可广泛应用。
2.冰奶、冰淇淋等食品添加剂，以减少冰渣，改善此类食品的口感；3.制成专用防冻剂，供登山运动员和高寒地区边防军等作业人员防冻用；4.可作高级防冻化妆品添加剂，包括化妆品制作过程中的防冻剂等等。
抗冻蛋白先后在海洋鱼和某些越冬昆虫中发现，鱼类生活在海水中，冰层下的水温最低也只是-1.9℃，所以鱼类抗冻蛋白的抗冻性能显然很有限。昆虫中的抗冻蛋白比鱼类抗冻蛋白活性高，抗冻植物生长于严冬零下几十度的环境下，目前已在拟南芥属(Arabidopsis thaliana)中发现了类似于鱼类的抗冻蛋白(Kurkela等1990)，1992年Griffith等将冷驯化的黑麦(Secale cerealeL.CV musketeer)的叶子中提取了黑麦抗冻蛋白，提取过程是将黑麦新鲜叶子切成2cm长，蒸馏水冲洗3次，在5mMEDTA、10mM脱落酸、10mM巯基乙醇、1mMPMSF、2mM己酸、2mM苯甲脒中真空渗透20分钟，沥干，装入20ml针筒，插入50ml离心管内在830g离心20分钟，从管子底部收集类囊体抽提物。用超滤器以50mM碳酸氢胺超滤，浓缩类囊体抽提物至1/5体积，在50mM碳酸氢胺中过丙烯葡聚糖-200柱，收集其抗冻蛋白。这种从黑麦中提取的抗冻蛋白活性低，在60mg/ml浓度下观察到含有类似于鱼类抗冻蛋白的双锥体或针形冰晶，在该浓度下冰冻温度-1.1℃，它们的分子量范围为9—36KDa。
本发明目的在于提供一种融点较上述抗冻蛋白低得多的高活性植物抗冻蛋白，以及从抗冻植物中分离该植物抗冻蛋白的分离技术，这种抗冻蛋白是从抗冻植物(如沙冬青、雪莲等)中分离出来的一种高活性植物抗冻蛋白，其分离技术方法稳定，可以应用于工业生产。
本发明所述的植物抗冻蛋白是从抗寒植物中分离的一种高活性抗冻蛋白，这种含抗冻蛋白的植物经匀浆，用30％，60％和90％硫酸铵饱和度下沉淀的蛋白质，经DE—52处理后用SephadexG100所分离到的蛋白质有2个峰，第1峰即大分子量部分的数量较少，第2峰是其主体(
图1)，第1峰与第2峰的紫外吸收光谱特征基本一致，而与波长呈反向关系(图2)。经生物活性检测，峰1和峰2均具有抗冻活性，但峰2含有主要的活性组份。峰2样品在33mg/ml的浓度下，融点为-10℃—-14℃，用相差显微镜可观察到呈多边形立体结构的抗冻蛋白冰晶(图3)。再经灌柱层析分离纯化可获得活性更高的植物抗冻蛋白，20mg/ml浓度下，融点约为-15℃～-20℃(图4)，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染后，测定分子量范围为94-13KDa，其中主要包括41、38、34、24、15和13KDa等，尤其34和或15KDa的活性更高(图5)。
附图1为用30-60％硫酸饱和度下沉淀的沙冬青蛋白质，经DE-52柱和SephadexG100分离的抗冻蛋白峰1和峰2，两峰均有抗冻蛋白的活性，但在峰2有主要的抗冻蛋白活性组份。
附图2为该高活性抗冻蛋白的紫外吸收光谱特性曲线，用30％(▲)，30—60％(●和○)，90％(△)硫酸铵饱和度下沉淀的沙冬青抗冻蛋白质，经DE-52柱和SephadexG100分离的抗冻蛋白。其中(○)为SephadexG100分离的峰1抗冻蛋白，其余均为峰2抗冻蛋白。
附图3在100-200倍相差显微镜下观察到的沙冬青抗冻蛋白呈双锥体等多边形冰晶形态。
附图4为AFPs的灌注层析分离。按美国博大生物技术公司提供的仪器与试剂系统分离AFPs。
(a)上柱样品
DE-52柱梯度洗脱的前半峰，并经SephadexG100分离的峰2样品。抗冻蛋白活性组份是38—41管，在21.4mg/ml蛋白浓度，融点低于-15℃。
(b)上柱样品DE-52柱梯度洗脱的后半峰，经SephadexG100分离的峰2样品。抗冻蛋白活性组份是其中31—36管，在17.5mg/ml蛋白浓度，融点低于-10℃；38—42管，在20mg/ml蛋白浓度融点低于-15℃。
附图5为AFPs的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离胶和浓缩胶浓度分别为15％和4.5％，300V电泳3小时，银染。
(1)图4b中的38—42管样品，分子量包括41、38、34、24、15、13KDa。抗冻活性见图4b说明。
(2)图4b中的31-36管样品，分子量包括41、38、24、13KDa抗冻活性见图4b说明。
(3)图4a中18—20管样品。抗冻活性不高，属弃去部份。
有关抗冻活性测定结果见图4，由于(1)比(2)的抗冻活性高得多，电泳结果增加34KDa和15KDa分子量电泳带，所以34KDa和或15KDa是更高活性抗冻蛋白。
本发明所提供的植物抗冻蛋白是从沙冬青或雪莲等抗冻植物中分离出来的，其分离技术具体步骤如下1.将新鲜的或冷冻(-20℃—-80℃)的抗冻植物与溶液(1)、按一定重量体积比混合、高速匀浆成匀浆液。溶液(1)具体成份及配比为1.5—3.0mMTris—HCl，0.1MKCl，pH值为7—8，溶液(1)中还含有0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，1mMPMSF，2.将上述匀浆液经挤压，去渣，获得其清液，3.将上述清液经20000g离心，15分钟，弃去沉淀，4.上清液加硫酸铵至30％或90％或30—60％或60—90％饱和度，再经20000g离心15分钟收集沉淀物，5.在收集的沉淀物中加溶液(2)，溶解沉淀物，经超滤器超滤脱盐，溶液(2)成分及配比为5mMTris-HCl，pH值为7-8，0.1MKCl，溶液(2)中还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，6.上DE—52离子交换柱，将非蛋白杂质除去，获得较纯净的蛋白质。
经脱盐后的样品，用溶液(2)适当稀释，上到经常规酸碱处理并经溶液(2)平衡的DE—52柱，上柱后，再用适量溶液(2)洗去非特异性吸附的杂质达到流出液经紫外检测已无明显蛋白质洗出，即平衡。
7.用梯度仪以溶液(2)—溶液(3)梯度洗脱，洗脱液经超滤、浓缩，溶液(2)成份及配比同步骤5中溶液(2)，溶液(3)成份及配比0.5MKCl，25mMTris-HCl，pH值为7-8，溶液(3)中还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，8.将已经浓缩的样品用溶液(4)过分子筛SephadexG100柱，
溶液(4)成份及配比25mMTris-HCl，pH值为7-8，0.1MKCl还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，9.分离样品，经超滤脱盐，浓缩，冷冻干燥制得。
本发明提供的高活性植物抗冻蛋白制品，如要进一步纯化获得更高活性的抗冻蛋白，用灌注层析分离和纯化抗冻蛋白。
上述方法制得的植物抗冻蛋白成品的测定与特点紫外测定估算得出所得蛋白量，计算式1.55×O.0.280—0.76×O.D.260＝mg/ml将经过上述分离技术1—8步骤即用30％或60％或30—60％或60—90％硫酸铵饱和度下沉淀的蛋白质，经DE—52处理后，用SephadexG100所分离到蛋白质有2个峰，如附图1为30—60％硫酸铵饱和度沉淀物，经DE—52柱后，SephadexG100分离的植物抗冻蛋白峰1和峰2示意图，图1中(1)为植物抗冻蛋白峰1，(2)为植物抗冻蛋白峰2，附图2为该植物抗冻蛋白的紫外线吸收光谱特性曲线用30％(图中用▲表示)，30—60％(图中用●和○表示)，90％(图中用△表示)硫酸铵饱和度沉淀物，经DE—52柱后，SephahexG100分离的植物抗冻蛋白峰1和峰2的紫外吸收光谱特性曲线。
经生化活性检测，峰1和峰2均具有抗冻活性，特点在于(1)本法通过硫酸铵分部沉淀技术，分离与浓缩了蛋白质，去除了大部分杂质，(2)通过DE—52离子交换，进一步排除非蛋白质成份，这对上柱流出液和平衡液的检测中，按1.55×0.D.280—0.76×0.D.260＝mg/ml计算几乎为0，说明流出液和平衡液不是蛋白质，而是杂质，通过溶液(2)—溶液(3)的梯度洗脱，获得进一步纯化蛋白质的目的。
(3)通过SephadexG100，分离到不同分子量的2个主峰，经鉴定属高活性的抗冻蛋白组成部分，该2个蛋白峰，合计收率约为冻干样品的0.1％。
(4)我们曾参照Griffith等1992的方法，利用丙烯葡聚糖300分离抗冻蛋白，难于测出抗冻蛋白的活性，Griffith利用新鲜的黑麦为材料，我们使用的是冷冻过的沙冬青，本法既适用于冷冻保存材料，也可使用新鲜材料，便利于保存材料，大规模生产。
(5)本法使用的硫酸铵，DE—52纤维素和Sephadex价格便宜，而丙烯葡聚糖十分昂贵。
(6)沙冬青抗冻蛋白的冰晶呈立体多边形(图3)。
(7)本法经硫酸铵沉淀，DE—52和SephadexG100分离到的沙冬青抗冻蛋白，在30mg/ml浓度下的融化点为-10℃—-14℃左右。经灌注层析进一步纯化的抗冻蛋白，在20mg/ml浓度下融点为-15℃—-20℃。
(8)经SDS·聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染检测其分子量范围为94-13KDa，其中包括主要的分子量是41、38、34、24、15、13KDa(图5)。
(9)沙冬青抗冻蛋白的可能应用范围A.高级防冻化妆品添加剂包括化妆品制作中的防冻(因化妆品制作中有时可能冻坏)和成品抗冻剂。
B.登山队和边防军专用防冻剂。
C.冰奶，冰淇淋等食品添加剂，减少冰渣，改善口味。
D.实用仪器防冻剂，例如目前在地震检测仪上使用进口防冻剂，经融点与冰点测定比较，本法制备的沙冬青抗冻蛋白防冻效果远远优于进口防冻剂。
E.细胞，组织，器官，胚胎低温保藏保护剂，保护细胞膜和细胞骨架的稳定性，降低冷害损伤，故可试用于器官移植等医学上的广泛应用。
实施例1由抗冻植物沙冬青叶子中分离植物抗冻蛋白1.用捣碎机粉碎冻干的沙冬青100g与2倍沙冬青重量的溶液(1)混合，高速捣碎成匀浆。
溶液(1)成份与配比为25mMTris-HCl，pH值为7.4，0.1MKCl，还含有0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，1mMPMSF。
2.在尼龙布内挤压出清液。
3.将清液20000g离心15分钟，弃去沉淀，4.加硫酸铵至30％硫酸铵饱和度，沉淀蛋白质，并收取沉淀物，
5.沉淀物中加溶液(2)、溶解沉淀物，经超滤器超滤，脱盐，溶液(2)成份与配比5mMTris-HCl，pH值为7.4，0.1MKCl，还含有0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇。
6.上DE—52离子交换柱，经脱盐后的样品，用溶液(2)适当稀释，上到经常规酸碱处理并经溶液(2)平衡的DE—52离子交换柱，上柱后再用适量溶液(2)平衡洗去非特异性吸附的杂质，达到流出液经紫外检测无明显蛋白质洗出即平衡。
7.用梯度仪以溶液(2)，溶液(3)进行梯度洗脱，洗脱液经超滤脱盐、浓缩，溶液(2)成份与配比同步骤5中溶液(2)，溶液(3)成份与配比为0.5MKCl，25mMTris—HCl，pH值为7.4，还含有0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇。
8.用溶液(4)过分子筛SephadexG100柱溶液(4)成份与配比为25mMTris—HCl，pH值为7.4，0.1MKCl，还含有0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇。
9.分离样品，经超滤脱盐，浓缩，冷冻干燥，制得沙冬青抗冻蛋白制品，由SephadexG100分离的峰2样品，在100mg/ml浓度下，融点为-13.3℃。
实施例2由抗冻植物沙冬青叶子中分离沙冬青抗冻蛋白投100g冷冻沙冬青叶子，第1、2、3步骤同实施例1。
4.90％硫酸铵饱和度，沉定蛋白质，并收取沉淀物，第5、6、7、8步骤同实施例1。
9.分离样品，经超滤脱盐，浓缩，冷冻干燥，制得沙冬青抗冻蛋白制品。收率为冻干沙冬青叶子的0.2％。
其中SephadexG100分离的峰2样品，在100mg/ml浓度下，融点为-13.6℃。
实施例3由抗冻植物沙冬青叶子中分离沙冬青抗冻蛋白，投450g冷冻沙冬青，第1—3步骤同实施例1。
4.加硫酸铵至30％饱和度，沉淀蛋白质，并收取沉淀物，保留上清液。
第5、6、7、8步骤同实施例1。
9.分离样品，经超滤脱盐，浓缩，冷冻干燥，制得沙冬青抗冻蛋白制品0.018g，制成率为0.004％，其中SephadexG100峰1为0.001％，峰2为0.003％。
实施4，投料450g冷冻沙冬青。
第1、2、3步骤同实施例3。
4.在实施例3的第4步保留的清液中继续加硫酸铵至60％饱和度(即30—60％饱和度)收集沉淀物，保留清液。
第5、6、7、8、9步骤同实施例3，收率为0.096％。
其中SephadexG100峰1为0.023％，在100mg/ml浓度下融点为-10℃，峰2为0.073％，在33mg/ml浓度下，融点为-14℃。将该峰2用灌注层析分离，获得更纯更高活性的抗冻蛋白，在20—21.4mg/ml浓度下，融点-15℃—-20℃(图4)。
实施例5投料450g冷冻沙冬青。
第1、2、3步骤同实施例3。
4.在实施4的第4步保留的清液中加硫酸铵至90％饱和度(即60—90％饱和度)收集沉淀物。
第5、6、7、8、9步骤同实施例3，收率为0.089％，其中SephadexG100，峰1为0.045％，峰2为0.044％，如果按30％，30—60％，60—90％硫酸胺饱和度的沉淀物，经DE—52，SephadexG100分离的全部抗冻蛋白的总收率为0.189％(即0.004％＋0.096％＋0.089％＝0.189％)。
实施6由抗冻植物雪莲中分离雪莲抗冻蛋白。
制备雪莲抗冻蛋白与制备沙冬青抗冻蛋白的方法步骤基本一致，除溶液(2)的成份配比需改为25mMTris-HCl，pH7-8，0.25MKCl，0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇外，其余完全相同于沙冬青抗冻蛋白的制备方法及步骤。
雪莲抽提物用70％硫酸铵饱和度沉淀蛋白，经DE—52柱和SephadexG100分离的峰1和峰2，在30—40/ml浓度下，其融点低于-11℃。
权利要求
1.一种高活性植物抗冻蛋白，其特征在于是从抗寒植物中分离出来的一种高活性抗冻蛋白，含该高活性抗冻蛋白的抗寒植物经匀浆、硫酸铵沉淀、DE—52离子交换柱和SephadexG100分离的产品，在30mg/ml浓度下，融点约为-10℃--14℃，再经灌注层析分离纯化、20mg/ml浓度下，融点约为-15℃--20℃，在相差镜下可观察到呈多边形立体结构冰晶，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染后，测定分子量范围为94—13KDa，其中包括41、38、34、24、15和13KDa等，尤其34和/或15KDa抗冻活性更高。
2.一种高活性植物抗冻蛋白的分离技术，其特征在于其分离技术具体步骤如下(1)将抗冻植物和溶液(1)按一定重量体积比混合、搅拌并高速匀浆，使其成均匀浆液将新鲜的或冷冻(-20℃--80℃)的抗寒植物置入溶液(1)中、混合、高速匀浆成匀浆液，溶液(1)具体成份及配比为1.5—3.0mMTris—HCl，0.1MkCl，pH值为7—8，溶液(1)中还含有0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，1mMPMSF。(2)将上述匀浆液经挤压、去渣、获得其清液，(3)将上述清液经20000g离心15分钟，弃去沉淀，(4)加硫酸铵至30％或90％或30—60％或60—90％饱和度，再经20000g离心15分钟收集沉淀物，(5)在收集的沉淀物中加溶液(2)，溶解沉淀物，经超滤器超滤脱盐，溶液(2)成分及配比为5mMTris—HCl，pH值为7-8，0.1MKCl，溶液(2)中还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇。(6)上DE—52离子交换柱，将非蛋白杂质除去，获得较纯净的蛋白质。经脱盐后的样品，用溶液(2)适当稀释，上到经常规酸碱处理并经溶液(2)平衡的DE—52柱，上柱后，再用适量溶液(2)洗去非特异性吸附的杂质，达到流出液经紫外检测已无明显蛋白质洗出，即平衡，(7)用梯度仪以溶液(2)—溶液(3)梯度洗脱，洗脱液经超滤，浓缩。溶液(2)成份及配比同步骤(5)中溶液(2)，溶液(3)成份及配比0.5MKCl，25mMTris-HCl，pH值为7-8，溶液(3)中还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，(8)将已经浓缩的样品用溶液(4)过分子筛SephadexG100柱，溶液(4)成份及配比25mMTris-HCl、pH值为7-8，0.1MKCl，还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，(9)分离样品、经超滤脱盐、浓缩、冷冻干燥即制得本发明提供的高活性植物抗冻蛋白；
3.按权利要求2所述的高活性植物抗冻蛋白分离技术，其特征在于用灌注层析分离技术，可制得进一步纯化的高活性植物抗冻蛋白。
全文摘要
从抗寒植物分离的高活性植物抗冻蛋白及分离技术的特征是抗寒植物经匀浆、硫酸铵沉淀，DE-52离子交换柱和SephadexG100分离的抗冻蛋白，在30mg/ml浓度下，融点为-10℃～-14℃，再经灌注层析分离可得更高活性的抗冻蛋白，20mg/ml浓度下，融点为-15℃～-20℃，用相差显微镜在低温下可观察到呈多边形立体结构冰晶、用SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳并银染后，测定其分子量范围为94-13KDa，其中包括41、38、34、24、15和13KDa。分离技术包括匀浆、离心、超滤、脱盐、上离子交换柱、梯度洗脱、过分子筛、浓缩、冷冻干燥等步骤。该方法稳定，可应用于工业生产、有极大的经济效益。
文档编号C07K1/00GK1117497SQ9411501
公开日1996年2月28日 申请日期1994年8月24日 优先权日1994年8月24日
发明者费云标, 孙龙华, 黄涛, 舒念红, 高素琴, 赵淑慧, 简令成 申请人:中国科学院发育生物学研究所