专利名称：一种利用荧光原位杂交分离植物细胞中染色体的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用荧光原位杂交分离植物细胞中染色体的方法。
背景技术：
染色体显微分离是指在显微镜下对染色体进行分离或切割，从而获得特定染色 体或染色体片段的一门技术。它是染色体显微克隆的基础，是遗传学研究的有力手
段。目前染色体显微分离与切割的方法主要有3种，即玻璃针法、激光切割法、流 式细胞仪法。其中，玻璃针法是借助倒置显微镜用尖端直径不超过0.5Wn的细玻璃 针对目标染色体进行直接切割，该方法以其简单方便，费用低廉的优势受到绝大多 数研究者的青睐。
由于植物细胞和染色体结构的特殊性，植物染色体的显微分离技术研究起步较 晚。早期的显微分离只能在一些易于辨认的染色体上进行，例如带随体染色体或近 端部着丝点染色体等。近年来，染色体显微分离过程中也采用染色体显带技术进行 染色体识别，例如Kamisugia等利用激光切割法将还阳参染色体的C-带阳性区域切 割下来。但是，制作带纹清晰、适于显微分离的染色体标本尚有一定难度，且许多 植物染色体显带技术还不成熟，其应用受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用荧光原位杂交分离植物细胞中染色体的方法。 本发明提供的分离植物细胞中染色体的方法，包括如下步骤将挑取单条染色 体后的植物细胞进行荧光原位杂交，通过与相应的正常植物细胞的荧光原位杂交图 谱进行比较，确定挑取的单条染色体为哪条染色体，从而分离出目的染色体。 所述植物可为小麦。
所述原位杂交所用的探针具体可为p^sl和/或p历G38;所述p血l如序列表的 序列l所示；所述P历G38如序列表的序列2所示。
以pJsl单个含重复序列的克隆为探针可以区分小麦7对D组染色体(Wang, J.， Xiang， F. N. ， and Xia， G. M. 2005. Agropyron elongatum chromatin localization on the wheat chromosomes in an introgression line. Planta. 277 - 286)，
p力sl和p历G38中两个重复序列的克隆搭配可以区分小麦全部的染色体(Pedersen，C. ， and Langridge， P. 1997. Identification of the entire chromosome component of bread wheat by two-color FISH. Genome邻 589-593.)。
所述方法在获得小麦染色体的微克隆文库中的应用也属于本发明的保护范围。 荧光原位杂交是指用特殊修饰的核苷酸标记的DNA探针直接与染色体DNA杂 交，再用荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子间的特异性结合来检测DNA分子 在染色体上的位置和分布。本发明把荧光原位杂交与显微分离技术结合起来，对挑 取单条染色体后的细胞进行原位杂交，利用具有特异谱带染色体的缺失来确定分离 染色体的身份。利用本发明的方法具有如下优点可以分离那些形态相近，但具有 特异谱带的染色体，拓宽了染色体分离的范围；避免了染色体标本制作过程中不必 要的化学处理，防止染色体DNA受到损伤，最大限度地保证了分离到的DNA的完整 性。应用本发明的方法可以获得小麦全部染色体的微克隆文库。本发明首次利用重 复序列为探针进行荧光原位杂交分析，根据杂交谱带确认染色体的身份，具有简便， 准确等特点。
图1为未挑取单条染色体前的细胞照片(含完整的42条染色体，箭头所示目
标染色体)。
图2为玻璃微针挑取的单条染色体的照片。
图3为目标染色体挑走后的细胞(还保留41条染色体)。
图4为挑取单挑染色体后的细胞的FISH图；绿色为pAl杂交带。
图5为用pAl进行FISH的中国春小麦的标准谱带。
图6为用p力sl和p欣G38进行FISH的中国春小麦的标准谱带。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊 说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下百分含量，如无特殊说明，均为 质量百分含量。
实施例中所用的小麦品种为"小偃54"，含42条染色体，该小麦购自河南省 高科种业有限公司。
实施例l、小麦染色体的显微分离技术一、 染色体制片
小麦种子在垫有双层滤纸的培养皿23'C发芽，露白后在4"C下处理24小时， 然后转入23'C恒温培养24小时，剪取发芽种子的根，于0t:冰水下处理36小时， 吸干根尖表面水分后立即置于新配的卡诺氏固定液(无水乙醇冰醋酸=3 : 1)中 固定10分钟，转入70%乙醇(体积百分含量)中，4'C保存待用。取已固定的根尖， 用无菌水冲洗干净，无菌条件下切取根尖置于2%纤维素酶(1 -10 Yakult.)与2。/。果 胶酶(Y-23 Yakult. ) 1 : l配置的混合液中，37。C酶解3小时，用无菌水轻轻冲洗 2次，1%醋酸洋红染色压片，-201下无菌条件保存备用。
二、 染色体的显微分离
使用Leitz拉针仪，将直径lmm的玻璃棒尖端拉制成直径为0. 5Wn的玻璃微针， 然后在Leitz显微器(Code-No. 933114)帮助下，于Olympus倒置显微镜15 (目镜) X40(物镜)倍视野内找到染色体分散好，染色体形态清晰的细胞，并利用Olympus 照相装置对该细胞拍照(见图l)，选取目标染色体，在该处加一滴无菌水配置的 50%乙醇(体积百分含量)，控制显微操作器的螺旋杆，移动玻璃微针挑取目的染 色体(见图2)，最后将玻璃针尖上的染色体折断于含有20MLLA的收集液(20ng/叱 的蛋白酶K， 1XT4连接酶缓冲液，无菌水)中，12，000rpra下离心1分钟，-20°C 下保存备用。再次对该细胞进行拍照(见图3)，并将该片2(TC下保存。
三、 标记探针
将串联重复序列pAl (见序列表的序列l)插入pUC18载体(宝生物工程(大 连)有限公司，产品货号D3218)，得到重组质粒。利用普通质粒小提试剂盒
(TIANGEN)提取重组质粒，并稀释质粒浓度为1^/叱用于探针标记。采用缺口平 移法，用地高辛(Digoxigenin-11-dUTP， Roche)标记该质粒；每1个反应体系(20叱) 含1Pg质粒DNA和机Digoxigenin Nick Translation Mix; 15。C下反应90分钟， 加入1叱0.5M EDTA终止反应，-20。C下保存备用。
四、 基因组原位杂交
将步骤二保存的染色体片于60。C烘干2小时，37。C下经RNase A (100 Pg/mL， 2X SSC配制)处理l小时，2X SSC室温漂洗5分钟，室温下用70%-95%-100%乙 醇(体积百分含量)依次脱水各5分钟，气干，于70'〇下在70%甲酰胺(2X SSC 配制)(体积百分含量)中变性后，立即在70%-95%-100%冷乙醇(体积百分含量) 脱水各5分钟，气干。杂交液(50%甲酰胺(体积百分含量)、10%硫酸葡聚糖、2X SSC、 0.1 mg/raL ssDNA、 5 Pg/mL地高辛标记的探针)于沸水浴中变性10分钟， 迅速冰浴10分钟以上，每张片子加20A杂交液，封口膜覆盖，37t:下杂交后于42 "C分别用2X SSC、 0. IX SSC和2X SSC各洗脱5分钟，然后在室温下用2XSSC洗 脱5分钟，随后转入检测缓冲液(0.2%Tween 20 (体积百分含量)，4X SSC配制) 洗脱5rain，滴干载玻片，在含有5% BSA的检测缓冲液中37 'C保温25分钟。信号 检测采用结合fluorescence isothiocyanate (FITC)的Anti-digoxigenin (Roche, Germany)试剂盒，在含0. 25 Pg/mL DAPI (4， 6-diamidino-2-phenylindole)的抗褪 色剂中复染3分钟并挤出多余液体，荧光显微镜镜检，对前次拍照的细胞进行照相 (见图4)。
五、染色体身份的确定
小麦品种"小偃54"体细胞染色体有42条，挑取1条后，发现在该细胞剩下 的41条染色体。将该细胞的荧光原位杂交谱带与普通小麦的标准谱带(见图5) (Wang， J. ， Xiang， F. N. ， and Xia， G. M. 2005. Agropyron elongatum chromatin localization on the wheat chromosomes in an introgression line. Planta. 277 - 286)进行对比，比较Msl杂交带型(绿色信号)，即可确定挑取染色体的 身份。例如，结果发现41条染色体中只有1条染色体呈现4D的特征谱带，即染色 体短臂中部、长臂近着丝点和近端部都明显分布pAl的杂交带，从而确定挑取的 为小麦染色体4D。
同时用pAl和pWG38可以区分小麦全部的染色体，因而可以分离出小麦的全 部染色体，具体方法参照实施例1。用P^sl和p历G38进行FISH的中国春小麦的标 准谱带见图6。序列表
〈110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
〈120〉 一种利用荧光原位杂交分离植物细胞中染色体的方法
〈130> CGGNARY92363
<160> 2
<210> 1
<211> 1015
<212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉
〈400> 1
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<210>2
〈211〉334
<212>腿
<213〉人工序列
〈220〉
〈223>
〈400〉2
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8
权利要求
1、一种分离植物细胞中染色体的方法，包括如下步骤将挑取单条染色体后的植物细胞进行荧光原位杂交，通过与相应的正常植物细胞的荧光原位杂交图谱进行比较，确定挑取的单条染色体为哪条染色体，从而分离出目的染色体。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物为小麦。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述原位杂交所用的探针为p力sl和 /或p欣G38。
4、 权利要求1至3中任一所述方法在获得小麦染色体的微克隆文库中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用荧光原位杂交分离植物细胞中染色体的方法。本发明提供的分离植物细胞中染色体的方法，包括如下步骤将挑取单条染色体后的植物细胞进行荧光原位杂交，通过与相应的正常植物细胞的荧光原位杂交图谱进行比较，确定挑取的单条染色体为哪条染色体，从而分离出目的染色体。本发明的方法具有如下优点可以分离形态相近，但具有特异谱带的染色体，拓宽了染色体分离的范围；避免了染色体标本制作过程中不必要的化学处理，防止染色体DNA受到损伤，最大限度地保证了分离到的DNA的完整性。应用本发明的方法能获得小麦全部染色体的微克隆文库。
文档编号C12N15/10GK101580832SQ20091008672
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月24日 优先权日2009年6月24日
发明者滨 李, 李宏伟, 李振声, 胡赞民, 琪 郑 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所