专利名称：一种y染色体str基因座荧光检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因座荧光标记复合扩增检验系统，具体涉及ー种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒及其应用。
背景技术：
短串联重复序列基因座(STR)是目前普遍应用的遗传标记，是2-6个bp长的串联重复序列，其长度在几十到几百bp之间。这种串联重复形成的DNA序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每ー种组合在群体中出现的频率都非常低，也就是说，STR基因座具有极高的个体鉴定能力，所以常作为遗传标记而被用于DNA分析技术中法医个体识别、亲缘关系鉴定，同时也是DNA数据库建立的主流技术。90年代初STR基因座多态性的发现，特别是STR基因座具有片段小容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩増，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库 方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。Y染色体是性染色体的ー种，属于近端着丝粒染色体。根据遗传方式不同可以将其分为两个区，即位于Y染色体两端的拟常染区(pseudoautosomal region, PAR)和Y特异区。減数分裂吋，拟常染区要与X染色体进行交换重组，而Y特异区则不发生交換，由父亲独立向下遗传给儿子，并且存有父系祖先的突变记录，是形成Y特异区多态性的基础。Y染色体突变率不超过常染色体，Y染色体的遗传标记位于非重组区，也就是说整个非重组区相当于ー个遗传标记，因此Y染色体遗传标记的个人识别能力和亲权鉴定能力不能像常染色体那样使用相乘原则，个人识别和亲权鉴定的评估十分有限。但是在国际惯例里面必须有三个以上基因座不同才能否认有血缘关系。为了达到足够的排除概率，法医DNA分析必须尽可能增加更多的Y染色体遗传标记。在法医鉴定领域，DNA分析主要依赖商业化的试剂盒进行。其中Applied Biosystems公司在2004年秋发布的包含17个Y-STR基因座的Yfiler 试剂盒，包括 DYS19、DYS385a/b、DYS389 I、DYS389 II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS456、DYS458、DYS635、Y GATA H4、DYS448，是目前可复合扩增Y-STR最多的商品化试剂盒和无锡中德美联生物技术有线公司在2011年研发的Y18试剂盒在Yfiler 的基础上增加了 DYS447。这些现有试剂盒主要是按照欧洲人群(主要为白人群体)统计选择的基因座位点，其中不少基因座的多态性在中国人群中比较低，如DYS391在中国人群中多态性小于O. 4，因而造成了个体识别能力低，在法医鉴定的实际应用中会遇到瓶颈，比如嫌疑人与不同几个家系的成员分型匹配，造成无法排查的情况，浪费了大量的人力物力。且由于Y染色体容易存在缺失的情况，造成基因座的丢失本应是同一个家系的无法认定，误导了侦破方向。因此，开发ー种基因座多态性高和能同时检测更多基因座的试剂盒，成为亲子鉴定、法医检测家系排查等迫切需要。且这个试剂盒与现有Y染色体STR的检测试剂盒，比如ABI的Yfiler试剂盒联用进行Y染色体STR基因座的检测，能够明显地提高Y染色体DNA检验系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合DNA检验的技术要求。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒。本发明的另ー目的是提供上述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
根据过去十几年针对中国人群Y染色体的研究，筛选 出针对中国男性GD (genediversity)数值高的Y染色体STR基因座，分别设计了其相对应的扩增引物，可同时分析人Y染色体DNA 24个基因座多态性。所述24个基因座见下表I :
表I
权利要求
1.一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于包含以下24个基因座的扩增引物核苷酸序列DYS531 :SEQ ID NO: I 2 ;DYS630 :SEQ ID NO: 3 4 ;DYS622 :SEQ IDNO:5^6 ；DYS552 SEQ ID NO:7 8 ;DYS510:SEQ ID NO:9 10 ;DYS449:SEQ ID NO:ll 12;DYS459a 和 DYS459b :SEQ ID NO: 13 14 ;DYS446 :SEQ ID NO: 15 16 ;DYS443 :SEQ IDNO: 17^18 ；DYS635 SEQ ID NO: 19 20 ;DYS587 :SEQ ID NO:21 22 ;DYS527a 和 DYS527b SEQ ID NO:23^24 ；DYS460 SEQ ID NO: 25 26 ;Y - GATA-A10 :SEQ ID NO: 27 28 ;DYS520 :SEQ ID NO:29^30 ；DYS557 SEQ ID NO:31 32 ;DYS522 :SEQ ID NO:33 34 ;DYS481 :SEQ IDNO: 35 36 ；DYS570 SEQ ID NO: 37 38 ;DYS385a 和 DYS385b SEQ ID NO: 39 40 ；DYS444 SEQID N0:41 42。
2.根据权利要求I所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于24个基因座的扩增引物浓度分别如下DYS531 和 DYS552 :0. 20 u M ；DYS630 :0. 25 u M ；DYS622 :0. 40 u M ;DYS510、DYS443和 DYS635 0. 80 u M ；DYS449 :0. 35 u M ；DYS459a 和 DYS459b :0. 55 u M ；DYS446 :0. 70 u M ；DYS587 1. 50uM ;DYS527a、DYS527b 和 DYS520 1. 35 u M ；DYS460 :0. 55 u M ； Y-GATA-A10 I.60 u M ；DYS557 1. 55 u M ；DYS522 1. 20 u M ；DYS481 1. 85 u M ;DYS570、DYS385a 和DYS385b 2. OOuM ；DYS444 :3. 00 u M ； 所述弓I物浓度均为上、下游弓I物的浓度。
3.根据权利要求2所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于每个基因座对应的引物中至少有一条序列的5’端进行荧光染料标记，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中的任意一种。
4.根据权利要求2所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于24个基因座的扩增引物核苷酸序列分为4组，分别进行5’端荧光染料标记 第一组DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510 和 DYS449，荧光染料标记物为 6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中的任意一种； 第二组DYS459a、DYS459b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a 和 DYS527b，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中第一组未使用的任意一种； 第三组DYS460、Y - GATA-AlO、DYS520、DYS557 和 DYS522，荧光染料标记物为 6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中第一组和第二组均未使用的任意一种； 第四组DYS481、DYS570、DYS385a、DYS385b 和 DYS444，荧光染料标记物为 6_FAM、HEX、TAMRA或ROX中前三组均未使用的任意一种。
5.根据权利要求4所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于试剂盒内设有内标，内标用SIZ作为橙色荧光标记物。
6.根据权利要求4所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还包括反应混合液和热启动Taq酶，所述反应混合液组成为MgCl2 7. 5mM, Tris-HCl 125mM,KCl 125mM, dNTPs 7. 5mM, BSA 2g/L。
7.权利要求r6任一所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤为 将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为95°C变性 llmin ;94°C lmin、62°C Imin 和 72°C Imin 共 10 个循环；90°C lmin、59°CImin和72°C Imin共20个循环；60°C延伸60min ;4°C保温得到扩增产物；扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪检测收集的数据。
8.权利要求f 6任一所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒在法医个体识别、亲权鉴定、人口迁移进化研究、人口历史和家系变化研究中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒及其应用，属于分子检测技术领域。本发明的试剂盒包含人Y染色体上24个基因座(DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570和DYS444)相对应的扩增引物。该检测试剂盒能够提高针对中国男性的累计个体识别力和累积非父排出率，提高个体鉴别力，对于法医个体识别、亲权鉴定、人口迁移进化研究、人口历史和家系变化研究等多个领域都有实践意义。
文档编号G01N21/64GK102676676SQ20121014963
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者刘宏, 刘超, 徐曲毅, 曹渊, 李越, 葛斌文, 郑卫国, 陈林丽 申请人:广州市刑事科学技术研究所, 无锡中德美联生物技术有限公司