专利名称：Y染色体复合扩增银染试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于体外一次性扩增Y染色体上的多个DNA目的片段的试剂盒。
背景技术：
人体的23对染色体中，决定性别的染色体叫做性染色体。性染色体分为X、Y两种。Y染色体是男性特有的，男性有带X、Y两种染色体的精子，女性只有带X染色体的卵子。当带Y染色体的精子与X染色体的卵子相结合受孕，产生的个体就是男性；而带X染色体的精子与带X染色体的卵子相结合，产生的个体则是女性。所以Y染色体只能由男性遗传，Y染色体的遗传标记也就随父系代代相传。与常染色体相比，Y染色体上的遗传标记不存在重组与交换。Y染色体遗传标记的特点可以运用到刑事案件的侦破上。对于个人识别的优点在于1.对阴道分泌物与精液构成的混合斑，分析Y染色体遗传标记可以不受女性成份的干扰。阴道分泌物与精液构成的混合斑痕(以下简称混合斑)是性犯罪案件最常见的法医物证检材。混合斑由两个人甚至多个人的体液构成，混合斑中阴道分泌物的量远远高于精液成份。国内外DNA实验室采用的遗传标记大多定位于常染色体，用常染色体DNA遗传标记分型时，大量阴道分泌物成份常常干扰和掩盖对精液成份的检测。因此，混合斑的个人识别是法医学迫切需要解决的难题。相比之下，检测Y染色体特异遗传标记时，由于阴道脱落上皮细胞不含这类遗传标记，阴道脱落上皮细胞含量多少将不会影响检测结果。更重要的是，Y染色体特异遗传标记可实现仅对精液成份分型，结果可与犯罪嫌疑人直接比较，解释结果更为简单。
2.用Y染色体遗传标记检测轮奸案的混合斑，可推知罪犯的最少人数，为侦察提供线索。
3.男性嫌疑人在逃的案件，可利用嫌疑人父系亲属的DNA进行Y染色体遗传标记分析。
Y染色体遗传标记对于亲权鉴定的优点在于1.父亲已死亡或失踪，可通过父系亲属Y染色体遗传标记进行父权鉴定2.可对兄弟、叔侄及爷孙隔代关系进行鉴定。
然而，人类Y染色体非重组区遗传标记很少，这是Y染色体遗传标记未能广泛应用的主要原因。所幸的是，“人类基因组计划”研究中发现了一类具有Y染色体特异性的DNA短串联重复序列(以下简称Y染色体特异STR基因座)，为法医学个人识别与亲权鉴定带来了新的希望，可以提供新的技术解决方案和新的检测手段。认识到Y染色体特异STR基因座的重要性，1996年和2000年在德国柏林分别召开了第一届和第二届国际法医Y染色体特异STR基因座分型协调会议。目前，Y染色体特异STR基因座是美国及欧洲国家法医学研究的重点之一。然而，与常染色体相比，极少有Y染色体特异STR基因座分型的商品试剂出现。原因在于Y染色体的结构中，长臂DNA有大量大片段重复，要求PCR反应条件比常染色体高得多；用对常染色体的方法进行Y染色体特异STR复合扩增极为困难。另一方面，除拟常染区外，Y染色体非重组区中的某些基因座与X染色体仍有部分同源序列，这些基因座在一定的PCR反应条件下不具男性特异性，进一步增加了设计Y染色体特异STR复合扩增体系的难度。
聚合酶链式反应(PCR)技术是目前常用体外DNA扩增技术。
在PCR反应时，首先需要一段长约17-20余个碱基的寡核苷酸片段作为引物(primer)，该引物是按照欲检测的DNA片段的两个5′端的碱基顺序合成的，PCR扩增的特异性取决于引物与模板的特异结合。整个扩增过程分三步(1)变性加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；(2)退火突然变温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单等特点，主要的结合发生在模板与引物之间；(3)延伸在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。上述三步为一循环，从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后DNA可扩增2n-2n倍。
目前国内外实验室对Y染色体STR遗传标记所采用的最主要的方法还是对其单个STR基因座进行PCR扩增，例如我们实验室侯一平等人在《ForensicScience Internetional》2001年第118(2-3)期中发表的《Allele sequencesof six new Y-STR loci and haplotypes in the Chinese Han population》文章中所介绍的方法。单个Y染色体STR基因座扩增较多个Y染色体STR基因座同时扩增(复合扩增)容易，条件较简单。但是，复合扩增有着单个基因座扩增所不具备的优势，一次能同时能同时扩增多个基因座，省时、经济。所以Y染色体STR基因座的复合扩增一直是国内外相关实验室研究的重点。目前，国内外对于Y染色体STR基因座的复合扩增的研究一直处于探索之中，虽然国外已有Y染色体STR基因座的试剂盒出售使用，但它们是基于荧光检测为基础的，即采用荧光标记引物、通过DNA自动测序仪进通过自动测序仪进行检测的方式。例如，Bulter JM等在《Forensic Science Internetional》2002年第129(1)期中发表的《A novel multiplex for simultaneousamplification of 20 Y chromosome STR markers》文章中所介绍的即是这种方法。而我们的试剂盒的检测原理与他们不同，我们是以银染法为基础设计的。他们检测的是DNA的单链结构(标记荧光的链)，而我们检测的是DNA的双链结构，目前国内外尚未报道相关技术与产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种可同时扩增四个基因座、扩增效率高、便于实验室操作和便于检测扩增效果的Y染色体复合扩增银染试剂盒。
本发明的Y染色体复合扩增银染试剂盒由分离包装的短引物YPA、短引物YPB、缓冲液(无Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2、B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2、C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2、D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型标准物构成，其中短引物YPA为非人类的基因组序列(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)；短引物YPB为非人类的基因组序列
(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)；A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2为分别在能够与人类的A基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2为分别在能够与人类的B基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2为分别在能够与人类的C基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2为分别在能够与人类的D基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；人工等位基因分型标准物共包括了A基因座分型标准物、B基因座分型标准物、C基因座分型标准物和D基因座分型标准物A基因座分型标准物为A基因座的长引物YPA-A-P1、YPB-A-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-A-P1、YPB-A-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一。
B基因座分型标准物为B基因座的长引物YPA-B-P1、YPB-B-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-B-P1、YPB-B-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一。
C基因座分型标准物为C基因座的长引物YPA-C-P1、YPB-C-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-C-P1、YPB-C-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一。
D基因座分型标准物为D基因座的长引物YPA-D-P1、YPB-D-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-D-P1、YPB-D-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一。
各组份的用量比为短引物YPA0.25～0.35ml(400nM)、短引物YPB0.25～0.35ml(400nM)、缓冲液(无Mgcl2)3.5～4.0ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl22.5～3.5ml(2.25mM)、A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2各0.25～0.35ml(40nM)、B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2各0.25～0.35ml(40nM)、C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2各0.25～0.35ml(40nM)、D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2各0.25～0.35ml(40nM)、人工等位基因分型标准物4ml(40nM)，在人工等位基因分型标准物中，A基因座分型标准物1ml(40nM)、B基因座分型标准物1ml(40nM)、C基因座分型标准物1ml(40nM)、D基因座分型标准物1ml(40nM)。
在本发明的试剂盒中，引物的设计是极其关键的，其基本思路是选取一对非人类基因组的短DNA片段作为上述短引物YPA和YPB，并在能与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端分别加上该对短引物，从而得到长引物YPA-P1和YPB-P2。此处，能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2亦即是可以与待扩增基因座的人类基因组结合的原始引物。由于复合扩增反应是同时对四个基因座A、B、C、D进行的PCR扩增，相对于不同基因座来说，能够与该基因座的人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2是不同的，与之相对应，四个待扩增基因座A、B、C、D的长引物YPA-P1和YPB-P2也因P1、P2的不同而不相同。在进行复合扩增反应时，可以同时在PCR反应体系中加入本试剂盒中分离包装的短引物YPA、短引物YPB、缓冲液(无Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、分型标准物和分别针对四个待扩增基因座A、B、C、D的长引物YPA-P1、YPB-P2，并加入常规PCR反应所需的单核苷酸。由于各个待扩增基因座A、B、C、D的人类基因组序列中并不含有短引物YPA、YPB所对应的序列，所以在该反应体系进行第一轮PCR反应时(经历前述变性、退火、延伸的一次循环过程)，短引物YPA、YPB并不会与人类基因组序列结合，所扩增的DNA片段还是由长引物YPA-P1、YPB-P2中所含的原来的引物对P1、P2所决定。但是，第一轮反应结束后，在待扩增基因座将会产生同时具有目的基因片段和非人类基因组序列YPA、YPB的扩增产物。在PCR反应体系进行第二轮PCR反应(即经历变性、退火、延伸的第二次循环过程)时，上述同时具有目的基因片段和非人类基因组序列YPA、YPB的产物被进一步扩增，扩增所用引物仍然是长引物YPA-P1、YPB-P2，反应完成后，所得到的产物同时具有目的基因片段和与短引物对YPA、YPB配对的非人类基因组序列。在本发明中，我们将上述以长引物作为反应引物的第一轮和第二轮PCR反应称之为第一阶段的反应，即复合扩增过程中第一阶段的聚合酶链反应。换句话说，复合扩增过程中第一阶段的聚合酶链反应包括了上述第一轮和第二轮反应。该阶段反应所得到的扩增产物同时具有目的基因片段和与短引物对(YPA、YPB)配对的非人类基因组序列，此处将其称之为复合扩增第一阶段的产物。从第三轮PCR反应开始，由于对于各个基因座已经具有上述第一阶段的产物，这样，短引物YPA、YPB就可以作为上述各个扩增基因座的引物，PCR反应就能以上述第一阶段的产物为模板进行扩增。与此相类似，在第三轮之后的各轮PCR反应中，均能够以短引物对(YPA、YPB)充当各个扩增基因座的引物。在经历多轮(如30轮)PCR循环反应之后，上述第一阶段的产物就会被扩增至上百万倍。在本发明中，我们将上述以短引物作为反应引物的PCR反应称之为第二阶段的反应，即复合扩增过程中第二阶段的聚合酶链反应。需要说明的是，在本发明的上述设计思路中，第一阶段和第二阶段的反应是在同一反应体系中进行的，而不是截然地分成两次反应。实际上，即使是在第三轮及第三轮之后的PCR反应中，仍然存在着上述第一阶段的反应，只是其所占比例极低而已。另外，在进行第一阶段的PCR扩增反应时有多对引物同时参与反应，即相对于多个待扩增基因座且序列不同的多对长引物同时参与反应(如前所述，各个待扩增基因座的长引物YPA-P1和YPB-P2并不相同)，引物与引物间的反应与竞争在所难免，从而大大降低了PCR扩增的效率，这一弊端在前面讨论现有技术时已经提及。但是，就本发明来说，第一阶段的PCR扩增的目的并不是希望获得大量的扩增片段，而仅仅是使同时带有目的基因片段和与YPA、YPB配对的非人类基因组序列的产物(第一阶段的产物)产生即可，因此上述弊端对整个复合扩增反应过程产生的影响是极其微弱的。而在第一阶段的PCR扩增之后，需要扩增的各个目的基因片段的5′端都带有与YPA、YPB配对的非人类基因组序列，所以加入一对短引物(YPA、YPB)之后，就可以对多个基因座同时进行扩增。由于在此后进行的第二阶段扩增中，参与反应的引物只有一对，即短引物对YPA、YPB，不存在引物间的竞争与反应，也无需调整引物间的浓度，从而大大提高了各基因座的扩增效率。因此可以说，第一阶段的PCR反应是仅需扩增出少量模板，而第二阶段的扩增是高效率扩增所有基因座。就其实质而言，在第二阶段的PCR反应中，是把现有复合扩增方法中的多对引物同时扩增多个基因座，转变为一对引物(YPA、YPB)同时扩增多个基因座；同时，相对于被扩增的各个特异性DNA片段来说，YPA、YPB并非是特异引物，因此，上述过程还由现有复合扩增方法中的由多对特异引物同时扩增多个特异性基因片段，转变成了由一对非特异引物同时扩增多个特异性基因片段。
在本发明的试剂盒中，上述短引物YPA、YPB的选取考虑了以下几个方面的要素①、它必须是非人类基因组序列，即它的序列不会与人类基因组序列相同或互补。②、选取适当的引物长度。大量实验结果表明，在设计引物时，引物长度是一个非常关键的参数，18～24个碱基构成的寡核苷酸链是比较优化的引物长度；引物过短，将会导致特异性的降低；引物过长，扩增退火时被引发的模板太少，在指数扩增期，甚至每一步退火步骤的小失误都将扩大，以致引起扩增产物的明显减少。③、选取引物中碱基GC的含量和引物的退火温度Tm。PCR反应的引物应该保持合理的GC含量。两条引物的GC含量和Tm值应该一致，兼容性差的引物对的扩增效率和特异性都较差。较低的Tm值会导致特异性的丧失，若采用太高的退火温度，扩增的效率将会非常低；如果退火温度太低，引物将产生非特异性退火，从而导致非特异性DNA片段的扩增。本发明在设计引物的Tm值时选择的温度是55℃，因为在该温度下，复合扩增中绝大多数的PCR反应都能进行，同时此温度将会使首次PCR反应后出现大量的非特异的杂带，我们就必须通过降低长引物的浓度来减少杂带。降低长引物浓度后，各引物之间的相互作用降低，非特异性的产物减少，与此同时，我们所需的特异性的产物也降低，但是这并不会影响整个扩增效率。前已述及，前两轮PCR反应仅仅是上述复合扩增过程的开端，该轮PCR反应的产物并不要求有较大的量，只需产生少量同时具有非人类基因组序列和目的基因的DNA片段，即生成少量用于第二阶段的PCR反应的模板，就能通过其后的PCR反应对该模板进行放量扩增。在第一阶段的PCR反应之后，参与反应的引物就不再是长引物对(YPA-P1、YPB-P2)，而是短引物对(YPA、YPB)。
通过检索人类基因数据库，在人类基因组中并不存在与上述短引物YPA、YPB相对应的序列，从而确保了该短引物不与人类基因组序列发生结合。
本发明的试剂盒是针对四个待扩增的Y染色体上的基因座A、B、C、D配制的，因此试剂盒中包含了四对长引物。上述长引物中所含的能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2实际上就是可以与待扩增的四个基因座A、B、C、D的人类基因组特异性结合的原始引物，它们可以通过检索在互联网上公开的人类基因数据库得到。此处，引物P1、P2的序列由待扩增基因座A、B、C、D的人类基因组序列所决定，且因待扩增基因座的序列的不同而不同。而在具体制作试剂盒产品时，可以根据该试剂盒所针对的四个待扩增的具体基因座A、B、C、D，检索在互联网上公开的人类基因数据库，得到与四个基因座A、B、C、D相对应的四个具体的引物序列。亦即是说，当产品所针对的四个基因座A、B、C、D是一定的时候，与之对应的四个具体引物序列对(P1、P2)就是确定的，而且是公知的。此时，根据本发明中给出的上述短引物，就能够制作出针对四个基因座A、B、C、D的长引物。另外，本发明试剂盒中所采用的上述缓冲液(无Mgcl2)、DNA聚合酶和Mgcl2等试剂均可直接采用现有的市售产品，如中国华美公司生产的产品，相应可以实现试剂的国产化。
本发明试剂盒中所包含的人工等位基因分型标准物是进行结果检测时分型的对照物，它是本发明试剂盒的一个重要组份。
在现有的试剂盒中，通常配备了等位基因分型标准物。等位基因分型标准物是指用于STR分型的已知序列的DNA片段群。为了实现实验室之间的分型标准化与质量控制，国际法医血液遗传学会(现名国际法医遗传学会，International Society of Forensic Genetics，ISFG)于1994年推荐了按核心序列串联重复拷贝数命名常染色体等位基因的原则，1997年再次强调了该命名原则以序列分析为基础的意义。在序列分析为基础构建的人类等位基因分型标准物对照下，可以避免按分子量测定值计算DNA片段长短所产生的误差。更重要的是，引物结合到基因组DNA上的位置是可以变化的，同一个体同一STR基因座用不同引物扩增将产生不同长短的DNA片段，而这些不同长短DNA片段的核心序列串联重复拷贝数是相同的。显然，核心序列串联重复拷贝数是个体具有的特征，是群体数据可比性的基础，是不同实验室取得相同分型结果的关键。这一命名原则早已被商品化常染色体STR基因座采用，也为国内外法医学者所熟悉。国内外可重复性分析结果表明只要将等位基因分型标准物与样本PCR扩增产物同步电泳，不同的实验室，不同的设备，不同的电泳方法，均可得到一致的可重复性结果。
本专利中的人工等位基因分型标准物与等位基因分型标准物的区别在于系列中DNA片段的序列与人类DNA序列只有部分是相同的，而另一部分是不同的(不同之处在于有一段非人类基因组序列在其中)。这种不同是本专利所述复合扩增与分型Y染色体特异STR基因座所必需，因此也是本专利的关键之一。
利用分子克隆技术可以制备本专利中所涉及的Y染色体特异STR基因座人工等位基因分型标准物。基本步骤是先用本专利设计的复合扩增体系扩增不同基因型个体，收集Y染色体特异STR基因座的各个等位基因片段，将其插入pUC重组质粒中，经DNA测序分析，证实插入片段的结构及大小，按国际法医遗传学会2001年公布的Y染色体特异STR基因座分型标准命名插入的等位基因片段，最后经转染、扩大培养，扩增及再鉴定后制备出人工等位基因分型标准物。
综上所述，由于本发明试剂盒中的引物与互联网上基因数据库中公布的引物(即P1、P2)不一致，本发明中的长引物是在互联网上基因数据库中公布的引物(P1、P2)的基础之上加入了短引物，因此不能再采用原基因数据库引物的扩增产物作本发明中的分型标准物。所以，在本发明的试剂盒中，针对各个待扩增基因座分别提供了人工等位基因分型标准物，即由各长引物扩增出来的PCR产物所对应的分型标准物，以供使用本发明试剂盒的实验室作对照物。就人工等位基因分型标准物的具体构成来说，它实际上是在互联网上公布的待扩增基因座的引物序列的PCR扩增产物的两端加上短引物序列而成，它因所选待扩增基因座的不同而不同。
与前述现有技术相比，本发明对试剂盒内的引物进行了设计，从而能够高效率地同时对Y染色体上的任意四个STR基因座进行复合扩增，扩增出大量的目的基因片段，实验结果的可重现性极高，无需在实验过程中繁琐地调整各对引物的浓度，简化了整个实验过程，同时，提供了特有的Y染色体复合扩增的人工等位基因分型标准物，可以方便地检测扩增结果。另外，采用本发明的试剂盒进行复合扩增反应之后，可以采用硝酸银染色方式检测结果，对实验设备的成本要求不高，而前述现有技术中仅能采用荧光标记引物、通过自动测序仪进行检测的方式，其对实验设备的要求高，因此本发明的产品更符合当前中国大多数分子生物学实验室的需要，具有中国特色。
本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。
具体实施例方式
实施例1本实施例中的试剂盒所针对的待扩增基因座分别为DYS434、DYS438、DYS439和C4，以下分别以A、B、C、D代表上述四个基因座。
在本实施例中，所给出的Y染色体复合扩增银染试剂盒由分离包装的短引物YPA、短引物YPB、缓冲液(无Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2、B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2、C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2、D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型标准物构成，其中短引物YPA为非人类的基因组序列(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)；短引物YPB为非人类的基因组序列(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)。
A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2为分别在能够与人类的A基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列。在本实施例中，互联网上基因数据库中公布的A基因座DYS434的引物P1、P2为P1 5’CACTCCCTGAGTGCTGGATT3’P2 5’GGAGATGAATGAATGGATGGA 3’与之相对应，本实施例中的A基因座长引物为YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CACTCCCTGAGTGCTGGATT 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GGAGATGAATGAATGGATGGA 3’
同样，B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2为分别在能够与人类的B基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列。在本实施例中，互联网上基因数据库中公布的B基因座DYS4 38的引物P1、P2为P15’TGGGGAATAGTTGAACGGTAA 3’P25’GTGGCAGACGCCTATAATCC 3’与之相对应，本实施例中的B基因座长引物为YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GTGGCAGACGCCTATAATCC 3’C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2为分别在能够与人类的C基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列。在本实施例中，互联网上基因数据库中公布的C基因座DYS439的引物P1、P2为P15’TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT 3’P25’GCCTGGCTTGGAATTCTTTT 3’与之相对应，本实施例中的C基因座长引物为YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT 3’D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2为分别在能够与人类的D基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列。在本实施例中，互联网上基因数据库中公布的D基因座C4的引物P1、P2为P15’GTGGAACCAGCCCAAATATC 3’P25’AATGCTCTCTTGGCTTCTCACT 3’与之相对应，本实施例中的D基因座长引物为YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GTGGAACCAGCCCAAATATC 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-AATGCTCTCTTGGCTTCTCACT 3’人工等位基因分型标准物共包括了A基因座分型标准物、B基因座分型标准物、C基因座分型标准物和D基因座分型标准物
A基因座分型标准物为A基因座的长引物YPA-A-P1、YPB-A-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-A-P1、YPB-A-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一。具体来说，在本实施例中，A基因座分型标准物的序列为长引物YPA-A-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-A-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS434)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
同理，B基因座分型标准物为B基因座的长引物YPA-B-P1、YPB-B-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-B-P1、YPB-B-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一。具体来说，在本实施例中，B基因座分型标准物的序列为长引物YPA-B-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-B-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS438)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
C基因座分型标准物为C基因座的长引物YPA-C-P1、YPB-C-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-C-P1、YPB-C-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一。具体来说，在本实施例中，C基因座分型标准物的序列为长引物YPA-C-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-C-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS439)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
D基因座分型标准物为D基因座的长引物YPA-D-P1、YPB-D-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-D-P1、YPB-D-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一。具体来说，在本实施例中，D基因座分型标准物的序列为长引物YPA-D-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-D-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(C4)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
在本实施例中，上述各组份的用量比为短引物YPA0.3ml(400nM)、短引物YPB0.3ml(400nM)、缓冲液(无Mgcl2)3.75ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl23ml(2.25mM)、A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2各0.3ml(40nM)、B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2各0.3ml(40nM)、C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2各0.3ml(40nM)、D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2各0.3ml(40nM)、人工等位基因分型标准物4ml，在人工等位基因分型标准物中，A基因座分型标准物1ml、B基因座分型标准物1ml、C基因座分型标准物1ml、D基因座分型标准物1ml。
在本实施例中，缓冲液(无Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2这三种试剂均由中国华美公司生产。其中，缓冲液的组分为500 mM KCl100 mM Tris-HCl1.0％ Triton X-100另外，本实施例中的试剂盒是针对1000个样本制作的。
实施例2本实施例中的试剂盒所针对的待扩增基因座分别为DYS456、DYS443、DYS444和DYS448，以下仍然分别以A、B、C、D代表上述四个基因座。
在本实施例中，除与上述四个基因座相对应的长引物和分型标准物的构成不同之外，试剂盒的其余成份及各成份的用量比均与实施例1相同。在本例中，互联网上基因数据库中公布的A基因座DYS456的引物P1、P2为P15’cccatcaactcagcccaaaac 3’P25’ggaccttgtgataatgtaagata 3’与之相对应，本实施例中的A基因座长引物为YPA-A-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-cccatcaactcagcccaaaac 3’YPB-A-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ggaccttgtgataatgtaagata 3’互联网上基因数据库中公布的B基因座DYS44 3的引物P1、P2为P15’tctttagctttttgcagccc 3’P25’tcattggccacctgcatta 3’与之相对应，本实施例中的B基因座长引物为YPA-B-P1 5’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tctttagctttttgcagccc 3’YPB-B-P2 5’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tcattggccacctgcatta 3’互联网上基因数据库中公布的C基因座DYS444的引物P1、P2为P15’tttctctcttcccactttaaccag 3’P25’ctcacgttgttcaagggtca 3’与之相对应，本实施例中的C基因座长引物为YPA-C-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tttctctcttcccactttaaccag 3’YPB-C-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ctcacgttgttcaagggtca 3’互联网上基因数据库中公布的D基因座DYS448的引物P1、P2为P15’tcttccttacgtgaatttcctc 3’P25’tgtcaaagagcttcaatggaga 3’与之相对应，本实施例中的D基因座长引物为YPA-D-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tcttccttacgtgaatttcctc 3’
YPB-D-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tgtcaaagagcttcaatggaga 3’在本实施例中，A基因座分型标准物的序列为长引物YPA-A-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-A-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS456)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
B基因座分型标准物的序列为长引物YPA-B-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-B-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS443)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
C基因座分型标准物的序列为长引物YPA-C-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-C-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS444)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
D基因座分型标准物的序列为长引物YPA-D-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-D-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS448)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
实施例3本实施例中的试剂盒所针对的待扩增基因座分别为DYS458、A10、DYS455和DYS457，以下仍然分别以A、B、C、D代表上述四个基因座。
在本实施例中，除与上述四个基因座相对应的长引物和分型标准物的构成不同之外，试剂盒的其余成份及各成份的用量比也与实施例1相同。在本例中，互联网上基因数据库中公布的A基因座DYS458的引物P1、P2为P15’agcaacaggaatgaaactccaat 3’P25’ccaccacgcccaccctcc 3’与之相对应，本实施例中的A基因座长引物为YPA-A-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-agcaacaggaatgaaactccaat 3’YPB-A-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ccaccacgcccaccctcc 3’互联网上基因数据库中公布的B基因座A10的引物P1、P2为P15’ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT 3’P25’CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA 3’与之相对应，本实施例中的B基因座长引物为YPA-B-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT 3’YPB-B-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA 3’互联网上基因数据库中公布的C基因座DYS455的引物P1、P2为P15’ggggtggaaacgagtgtt 3’P25’atctgagccgagccgagagaatgata 3’与之相对应，本实施例中的C基因座长引物为YPA-C-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ggggtggaaacgagtgtt 3’YPB-C-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-atctgagccgagccgagagaatgata 3’互联网上基因数据库中公布的D基因座DYS457的引物P1、P2为P15’tgcagcctcaatttcctggt 3’
P25’tatagatagatagataaccacag 3’与之相对应，本实施例中的D基因座长引物为YPA-D-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tgcagcctcaatttcctggt 3’YPB-D-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tatagatagatagataaccacag 3’在本实施例中，A基因座分型标准物的序列为长引物YPA-A-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-A-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS458)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
B基因座分型标准物的序列为长引物YPA-B-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-B-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(A10)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
C基因座分型标准物的序列为长引物YPA-C-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-C-P2经PCR反应的产物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS455)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
D基因座分型标准物的序列为长引物YPA-D-P1经PCR反应的产物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA长引物YPB-D-P2经PCR反应的产物
TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用该基因座(DYS457)原始引物进行PCR扩增后的序列，与互联网上的人类基因数据库中一致。
权利要求
1.一种Y染色体复合扩增银染试剂盒，其特征是由分离包装的短引物YPA、短引物YPB、缓冲液(无Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2、B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2、C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2、D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型标准物构成，其中短引物YPA、YPB为非人类的基因组序列YPA5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′；YPB5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′；A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2为分别在能够与人类的A基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2为分别在能够与人类的B基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2为分别在能够与人类的C基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2为分别在能够与人类的D基因座的基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因组序列；人工等位基因分型标准物共包括了A基因座分型标准物、B基因座分型标准物、C基因座分型标准物和D基因座分型标准物A基因座分型标准物为A基因座的长引物YPA-A-P1、YPB-A-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-A-P1、YPB-A-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一；B基因座分型标准物为B基因座的长引物YPA-B-P1、YPB-B-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-B-P1、YPB-B-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一；C基因座分型标准物为C基因座的长引物YPA-C-P1、YPB-C-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-C-P1、YPB-C-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一；D基因座分型标准物为D基因座的长引物YPA-D-P1、YPB-D-P2经聚合酶链式反应所得产物，且长引物YPA-D-P1、YPB-D-P2经PCR扩增所得产物各占其总重量的二分之一；各组份的用量比为短引物YPA0.25～0.35ml(400nM)、短引物YPB0.25～0.35ml(400nM)、缓冲液(无Mgcl2)3.5～4.0ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl22.5～3.5ml(2.25mM)、A基因座长引物YPA-A-P1和A基因座长引物YPB-A-P2各0.25～0.35ml(40nM)、B基因座长引物YPA-B-P1和B基因座长引物YPB-B-P2各0.25～0.35ml(40nM)、C基因座长引物YPA-C-P1和C基因座长引物YPB-C-P2各0.25～0.35ml(40nM)、D基因座长引物YPA-D-P1和D基因座长引物YPB-D-P2各0.25～0.35ml(40nM)、人工等位基因分型标准物4ml(40nM)，在人工等位基因分型标准物中，A基因座分型标准物1ml(40nM)、B基因座分型标准物1ml(40nM)、C基因座分型标准物1ml(40nM)、D基因座分型标准物1ml(40nM)。
全文摘要
一种Y染色体复合扩增银染试剂盒，其特征是由分离包装的短引物YPA、短引物YPB、缓冲液(无Mgcl
文档编号C12Q1/68GK1438329SQ0311742
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月10日 优先权日2003年3月10日
发明者侯一平, 李英碧, 应斌武, 冀强, 董建国, 吴谨, 张 申请人:四川大学