X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种PCR扩增试剂盒，尤其涉及一种单管同时检测12个X染色体MiniSTR基因座的荧光复合扩增试剂盒，本发明还涉及该荧光复合扩增试剂盒的制备方法以及该试剂盒在司法鉴定领域中的应用，属于X染色体分型和鉴定领域。
背景技术：
：短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)是人类基因组中由2~6个碱基作为核心单位串联重复形成的一类具有长度多态性的DNA序列，其核心单位的数目变化和重复次数不同构成了STR的遗传多态性。STR分布广、数目多，约占人类基因组的10%,所包含的遗传信息是以往任何多态性标记所无法比拟的，因此STR是目前法医DNA鉴定中最常用和最重要的遗传标记。X染色体STR(X-STR)属性染色体，在男性个体中呈单倍型形式存在，只能遗传给女儿，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有一个相同的等位基因；而男性中的X-STR只能从其母亲中得到，故孙女中X-STR基因座的等位基因有一半与其祖母相同。由于其遗传的特殊性，X染色体STR在亲权鉴定中存在一些其它染色体(如常染色体、Y染色体及线粒体)遗传标记无法比拟的优点。尤其在一些特殊的检案中，如缺乏双亲的同父异母姐妹亲缘关系认定或涉及父女关系的单亲亲权鉴定等方面，对于缺乏双亲的同父异母姐妹俩人认亲的案件，常染色体STR无法排除姐妹关系，线粒体的遗传标记也不能用来确定同父所生的关系。检测X染色体的STR基因座，若俩人间没有相同的等位基因，就可作俩人不是同父所生的结论；而对于单亲父女关系的鉴定案件，因父亲的X染色体必遗传给女儿，如果女儿的X-STR基因座的等位基因与被假定父亲的不同，可以直接排除父女关系，如果相同，则不能排除其父女关系。此外，性别鉴定也是法医学个人识别的重要内容之一，X染色体STR进行分型检测时，男性个体X-STR只显现一条等位基因片断，女性杂合子则显示两条等位基因片段，因此可以用来作为性别的辅助鉴定。此外，对于男性除精液(斑)外的体液(斑痕)或组织样品，单一男性样4品DNA只有一个X染色体DNA,X-STR基因座只有一个等位基因。如果出现两个或两个以上等位基因则表明被检样品混有其他个体DNA,为混合样品。即使是同胞个体间DNA混合样品，也有可能被检出。鉴于X染色体STR分型在法医特珠DNA检案中具有的重要价值，开发新的X-STR复合扩增试剂盒将有很好的发展前景。目前常染色体和Y染色体STR基因座在国际上应用较为广泛，已有多套成熟的商品化试剂盒出现，如ProfilerPlus、Cofiler、Identifiler、PowerPlex16、Y—PLEX12kit、AmpFLSTRY-filerkit。相比之下，尽管X染色体STR基因座具有高度的多态性，但X染色体STR基因座的研究及应用还不普遍，遗传学数据库(geneticdatabank,GDB)中绝大多数X-STR基因座尚未进行群体调查。商品化试剂盒也仅有德国的MentypeArgusX-8(DXS8378,HPRTB,DXS7423,DXS7132，DXS10134,DXS10074,DXS10101DXS10135),其在我国法医DNA检验中还存在基因座数目和个人识别能力的限制。国内文献报道的关于X-STR可复合扩增的基因座数目较少(通常3-6个)，且多为银染检测，在对扩增结果进行分析时，必然存在费时、自动化程度低，准确性差等弊病，虽然对实验设备的要求不高，符合当前国内法医基层实验室的需要，但却不能满足大多数已经具有自动激光荧光遗传分析仪的实验室的更高要求。而即便是采用荧光检测，也多是将若干用于单基因座扩增的引物直接加荧光标记复合扩增，但随着扩增体系中引物数量的增加，引物之间的相互影响严重，反应动力学变得复杂，扩增条件的优化变得极为困难，成为进一步增加复合扩增基因座数目的难点。本申请人曾作为中国发明专利ZL031355755.5的研发人员，把传统的多对引物扩增多个STR基因座(多重复合扩增反应)，转换为一对公共引物同时扩增多个STR基因座(一重复合扩增反应)，解决了上述传统复合扩增的技术难点。另一方面，MiniSTR技术通过重新设计引物，减小PCR-STR扩增产物片段长度是目前解决法医难检DM样本分型难题的一个新的发展方向。鉴于此，优选适合中国群体遗传分布和法医检验的X染色体STR基因座，结合MiniSTR技术，研发一套具有自主知识产权的X染色体复合扩增试剂，对特殊检案的DM样本正确分析和实现我国法医DNA检验关键试剂国产化具有重要意义。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有复合扩增试剂盒所存在的不足，提供一种可应用于法医特殊DM检案的X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，包括彼此独立包装扩增试剂和检测试剂组成，所述的扩增试剂包括引物混合物，DNA聚合酶，PCR反应缓冲液；所述的检测试剂包括内标和等位基因分型标准物Ladder;其中，所述的引物混合物由五条公共引物和24条加尾引物混合而成；所述的五条公共引物序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDN0:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示，其中，在SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5的5'端分别加上颜色互不相同的荧光标记物；所述的24条加尾引物的序列分别为SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29所示;所述内标由LIZ标记的90、120、150、180、210、240、270、300bp扩增产物组成；将由由LIZ标记的90、120、150、180、210、240、270、300bp扩增产物用乙醇沉淀后混合，调整各片段的量至电泳峰面积相近。作为线性内标(internallanestandard,ILS)，与待测样本混合加样电泳，GeneScanAnalysisSoftware3.7NT软件计算样本产物片段大小。所述等位基因分型标准物Ladder由A、B、C、D四组共12个X-STR基因座的等位基因分型标准物混合而成；所述的等位基因分型标准物为利用各个基因座的公共引物对该基因座在群体中观察到的所有等位基因进行扩增；PCR产物克隆；DNA测序证实插入片段的大小和结构；按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后；混合并调平衡所有的等位基因，使制备出的各个基因座的等位基因分型标准物等量。为了控制质量，本发明试剂盒的扩增试剂中还可进一步包括阳性对照和阴性对照；优选的，所述的阳性对照可以是9947A女性DM，所述的阴性对照可以是9948男性DNA;本发明技术方案的详细描述首先，12个X-STR基因座的复合扩增需要涉及四对公共引物对。本发明特别设6计了五条结构相似、片段大小一致、物理动力学特性相似的公共引物GA、GB、GC、GD、GE;这五条公共引物的序列分别为GA(5'-GTTTCTT-30(SEQIDNO:1)GB(-CGGTCGAT-)(SEQIDNO:2)GC(-CGGAATGC-)(SEQIDNO:3)GD(5,-CGGCTACG-)(SEQIDNO:4)GE(5'-CTAGATAC-)(SEQIDNO:5)其中，在GB、GC、GD和GE的5'端分别加上颜色互不相同的荧光标记物Fl、F2、F3或F4，得到荧光标记的公共引物；将这4条荧光标记的公共引物序列分别与公共序列GA相配合，构成了4对公共引物对，即公共引物对l:GA、GB;公共引物对2:GA、GC;公共引物对3:GA、GD;公共引物对4:GA、GE。其中，优选的，这四对公共引物在引物混合物中的终浓度分别为0.3~l|aM;所述荧光标记物Fl、F2、F3或F4可以分别釆用现有的不同颜色的荧光标记物，如现有的巿售蓝、绿、黄、红、桔色荧光标记物FAM、JOE、NED、ROX、LIZ以及其它类似荧光标记物。本发明所涉及的这五条公共引物与中国发明专利ZL031355755.5中的公共引物相比GA由原来的23个bp缩短到7个bp,GB、GC、GD、GE由原来的各24个bp缩短到8个bp。这样，每个基因座的扩增产物就较ZL031355755.5提供的试剂盒缩短了32bp,从而更有利于DM降解检材的分型；此外G+C含量和退火温度等参数更加优化。通过实验室检验证明本发明的这五条公共引物进行复合扩增效率更高。此外，这五条公共引物还可应用于常染色体STR和Y染色体STR复合扩增系统的建立，具有很宽泛的适用性。对于X染色体STR荧光复合扩增试剂盒，X染色体STR基因座的选择极为关键。综合各地区汉族人群的遗传多态性数据，筛选X染色体STR标准如下(l)多态性高，在中国人群中个体识别率(DP值)0.6以上；(2)串联重复单位尽量为四或五核苷酸；(3)作为位于同一X染色体的基因座，必须考虑到连锁遗传的问题。根据人类基因作图数据库中各基因座间的物理图距和群体调查基因座间的连锁不平衡分析，判断基因座之间是否存在连锁。如位于同一个连锁群之内，呈连锁遗传，便于以单倍型观察多态性；(4)易于扩增和分型；(5)灵敏度高，通常选择能够扩增0.2ng~lng模板DNA的基因座，对于法医中微量的DNA样本检测很重要；(6)各个引物的7b值相近，引物间兼容性好。(7)扩增产物片断尽量在100-300bp之间。基于上述原则，我们选择了DXSIOI、HPRTB、DXS6789、DXS6綱、DXS6801、DXS6809、DXS7132、DXS7424、DXS8377、DXS8378、DXS9898、DXS10011等12个X-STR作为本发明试剂盒的检测基因座。本发明根据各基因座扩增产物片段大小，退火温度相近、相互之间以及与引物在乾片断之外区域间同源性程度低等原则设计12个X-STR的分组组合，利用在线软件primer3、01igo6.O对片断大的基因座设计MiniSTR引物。X染色体MiniSTR引物设计原则(1)尽可能靠近STR核心重复序列，同时避免引物结合区碱基突变引起的扩增不均衡甚至假纯合子的情况；(2)引物长短适中，具有相似的物理特性和反应动力学特点、Tm值相近、GC含量，引物之间不能形成二聚体;(3)避开与Y染色体的同源体(homology),以保证各MiniSTR引物的X染色体特异性，即男性只有一条扩增片段，女性则可以有l至两条扩增片段。由于受限于STR核心重复序列的长度，MiniSTR的扩增片段长度不可能无限的减小，另外，引物区的选择余地很小，甚至于有些基因座无法找到合适的MiniSTR引物。因此，我们对片断大的DXS8378、DXS7132、DXS9898、HPRTB、DXS10011六个基因座设计了MiniSTR引物。而为了复合扩增的分组需要，将DXS6789基因座设计引物后的扩增片断增加了135bp。通过实验确证重新设计的引物使DXS8378、DXS7132、DXS6809、DXS9898、HPRTB基因座扩增产物长度分别缩短了88bp、152bp、32bp、37bp、129bp,有利于DNA降解检材的准确分型。12个X-STR基因座的遗传信息见表1。表112个X-STR基因座的遗传信息及MiniSTR产物片断<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>DXS7424Xq22.1-213-20147-176147-176HPRTBXq26.2150.3-183.8310-17392-420263-287129DXS8377Xq28_438-57204-261204-261_DXS腿1Xq28-430-46362-482148-268214其中，设计的DXS8378基因座的STR引物为PI:5'—CTTAGGCAACCCGGTGGT—3'P2:-GGCGACAAGAACGAAACTC-37设计的DXS7132基因座的MiniSTR引物为PI:5'—TCCCCTCTCATCTATCTGACTG—3'P2:5'-CACTCCTGGTGCCAAACTCT-3'设计的DXS9898基因座的MiniSTR引物为PI:5'-CGAGCACACCTACAAAAGCTG-3'P2:5'-TAGGCTCACCTCACTGAGCA-3'设计的HPRTB基因座的MiniSTR引物为PI:5'-CTCTCCAGAATAGTTAGATGTAGG-3'P2:5'-AATACACATCCCCATTCCTG-37设计的DXS6789基因座的STR引物为PI:5'-CTTCATTATGTGCTGGGGTAM-^P2:5,-ACCTCGTGATCATGTAAGTTGG-3'设计的DXS10011基因座的STR引物为PI:5'—CAGGGCAACAAGAGTGAAACT—3'P2:TCCTTCCTTCCTTCCTTTCC-3'本试剂盒中另外六个X-STR基因座的引物序列查自GDB基因数据库。其中，DXSIOI基因座的STR引物为PI:5'—ACTCTAAATCAGTCCAAATATCT—3'P2:-AAATCACTCCATGGCACATGTAT-3'DXS6800基因座的STR引物为PI:5'-GTGGGACCTTGTGATTGTGT-P2:-CTGGCTGACACTTAGGGAAA—DXS7424基因座的STR引物为Pl:5'-CTGCTTGAGTCCAGGAATTCAA-3,P2:—GAACACGCACATTTGAGAACATA—DXS8377基因座的STR引物为Pl:5'-CACTTCATGGCTTACCACAG-P2:-GACCTTTGGAAAGCTAGTGT-DXS6801基因座的STR引物为Pl:-AGTCATTTCCTCTAACAAGTCTCC-P2:-TCCAGAGAGTCAGAATCAGTAGG-DXS6809基因座的STR引物为Pl:5'-TGAACCTTCCTAGCTCAGGA-P2:-TCTGGAGAATCCAATTTTGC-本试剂盒中所述加尾引物即是在上述能够与人类基因组序列特异性结合的STR引物或MiniSTR引物Pl、P2的5'端分别加上这四对公共引物而构成，具体如下A组待扩增基因座分别为DXS8378、DXS9898、DXS8377和HPRTB。对应于A组X-STR基因座的加尾引物GA-P1和GB-P2为分别在A组基因座中的四个基因座的STR引物或MiniSTR引物的Pl、P2的5'端加上公共引物GA、GB而得到的序列。GA(-GTTTCTT-)GB(5,-CGGTCGAT-37)因此，DXS8378基因座的加尾MiniSTR引物为Pl:5'-GTTTCTT-CTTAGGCAACCCGGTGGT-y(SEQIDNO:6)P2:5'-CGGTCGAT-GGCGACAAGAACGAAACTC-(SEQIDNO:7)DXS9898基因座的加尾MiniSTR引物为Pl:5'-GTTTCTT-CGAGCACACCTACAAAAGCTG-3'(SEQIDNO:8)P2:5'-CGGTCGAT-TAGGCTCACCTCACTGAGCA-(SEQIDNO:9)DXS8377基因座的加尾STR引物为Pl:5'-GTTTCTT-CACTTCATGGCTTACCACAG-y(SEQIDNO:10)P2:57-CGGTCGAT-GACCTTTGGAAAGCTAGTGT-3'(SEQIDNO:11)HPRTB基因座的加尾MiniSTR引物为10-(SEQIDNO:12)P2:5'-CGGTCGAT-AATACACATCCCCATTCCTG-3'(SEQIDNO:13)B组待扩增基因座分别为MS6801、DXS7424、DXS6800和DXS6809。对应于B组X-STR基因座的加尾引物GA-Pl和GC-P2为分别在B组基因座中的四个基因座的STR引物或MiniSTR引物的Pl、P2的5'端加上公共引物GA、GC而得到的序列。GA(5,-GTTTCTT-)GC(-CGGAATGC-)因此，DXS6801基因座的加尾STR引物为PI:57-GTTTCTT-AGTCATTTCCTCTAACAAGTCTCC-3Z(SEQIDNO:14)P2:5'-CCGAATGC-TCCAGAGAGTCAGAATCAGTAGG"37(SEQIDNO:15)DXS7424基因座的加尾STR引物为PI:5'-GTTTCTT-CTGCTTGAGTCCAGGAATTCAA-3'(SEQIDNO:16)P2:57-CCGAATGC-GAACACGCACATTTGAGAACATA-3'(SEQIDNO:17)DXS6800基因座的加尾STR引物为PI:5'-GTTTCTT-GTGGGACCTTGTGATTGTGT-3'(SEQIDNO:18)P2:5'-CCGAATGC-CTGGCTGACACTTAGGGAAA-3'(SEQIDNO:19)DXS6809基因座的加尾STR引物为PI:5'-GTTTCTT-CTAGATTATGTAGGAATTTGG-3'(SEQIDNO:20)P2:5Z-CCGAATGC-TCTGGAGAATCCAATTTTGC-3'(SEQIDNO:21)C组待扩增基因座分别为DXS7132、DXS101和DXS6789。对应于C组X-STR基因座的加尾引物GA-P1和GD-P2为分别在C组基因座中的三个基因座的STR引物或MiniSTR引物的Pl、P2的5'端加上公共引物GA、GD而得到的序列。GA(5,-GTTTCTT-3,)GD(5'-CGGCTACG-)因此，DXS7132基因座的加尾MiniSTR引物为Pl:5'-GTTTCTT-TCCCCTCTCATCTATCTGACTG-3'(SEQIDNO:22)P2:5"—CGGCTACG-CACTCCTGGTGCCAAACTCT-3'(SEQIDNO:23)DXS101基因座的加尾STR引物为Pl:5'-GTTTCTT-ACTCTAAATCAGTCCAAATATCT-37(SEQIDNO:24)11P2:-CGGCTACG—AAATCACTCCATGGCACATGTAT-(SEQIDNO:25)DXS6789基因座的加尾STR引物为PI:5'-GTTTCTT-CTTCATTATGTGCTGGGGTAAA-3,(SEQIDNO:26)P2:5'-CGGCTACG-ACCTCGTGATCATGTAAGTTGG-3'(SEQIDNO:27)D组待扩增基因座为DXSlOOll。对应于D组X-STR基因座的加尾引物GA-P1和GD-P2为在D组基因座的MiniSTR引物的Pl、P2的5'端加上公共引物GA、GE而得到的序列。GA(5'-GTTTCTT-)GE(5'-CTAGATAC-3,)因此，DXSlOOll基因座的加尾MiniSTR引物为PI:5'-GTTTCTT-CAGGGCAACAAGAGTGAAACT-3'(SEQIDNO:28)P2:5'—CTAGATAC—TCCTTCCTTCCTTCCTTTCC—3,(SEQIDNO:29)优选的，上述12对加尾MiniSTR引物在引物混合物中的终浓度分别为0.15~1HM;本发明试剂盒中所述的内标是将由LIZ标记的90、120、150、180、210、240、270、300bp扩增产物用乙醇沉淀后混合，调整各片段的量至电泳峰面积相近而得到。所述的内标作为线性内标(internallanestandard,ILS),与待测样本混合加样电泳，使用GeneScanAnalysisSoftware3.7NT软件计算样本产物片段大小。在本发明试剂盒中，所述等位基因分型标准物Ladder由12个X染色体STR基因座的等位基因分型标准物混合而成；等位基因分型标准物是指用于STR分型的已知序列的DNA片段群，是进行结果检测时分型的对照物，只要将等位基因分型标准物与样本PCR扩增产物同步电泳，不同的实验室，不同的设备，不同的电泳方法，均可得到一致的可重复性结果。由于本发明试剂盒中的部分基因座是在重新设计的MiniSTR引物的基础之上，因此不能再采用原基因数据库STR引物的扩增产物作为本发明的分型标准物。在本发明试剂盒中，按X染色体MiniSTR分组情况制备等位基因分型标准物，利用公共引物对该基因座在群体中观察到的所有等位基因进行扩增；PCR产物克隆；DNA测序证实插入片段的大小和结构；按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后；混合并调平衡所有的等位基因，使制备出的各个基因座的等位基因分型标准物等量，即各个基因座的等位基因分型标准物的克分子量均相等。12本发明试剂盒仍釆用了中国发明专利ZL031355755.5中所涉及的多色荧光复合扩增原理(图1)。即以一对短DNA片段构成公共引物对(GA,GB);将上述公共引物分别加在能够与人类基因组序列特异性结合的STR引物或MiniSTR引物Pl、P2的5'端，构成一对非人类基因组序列，即加尾引物GA-P1、GB-P2。对于同一组中的不同基因座来说，待扩增基因座的加尾引物GA-Pl和GB-P2因STR引物或MiniSTR引物P1、P2的不同而不同。在复合扩增的第一阶段，所扩增的DM片段由各加尾引物中所含的Pl、P2决定。因此，第一阶段的扩增产物是同时具有目的基因片段和与公共引物配对的序列，即生成少量用于第二阶段PCR反应的模板。第二阶段扩增中，由于非人类基因组的公共引物序列已经整合到扩增产物中，荧光公共引物即可作为反应引物发挥作用。因此就每一组基因座来说，参与反应的引物只有一对荧光公共引物，即由多对反应引物扩增多个STR基因座转换为一对公共引物扩增多个STR基因座，降低了引物间的竟争与抑制且无需调整加尾引物间的浓度，从而大大提高了各基因座的扩增效率。经历多轮(如30轮)PCR循环反应之后，上述第一阶段的PCR产物被扩增至上百万倍。利用自动激光荧光遗传分析仪检测PCR产物，可根据公共引物5'端标记的荧光颜色及片段的迁移率检测到复合扩增的各个X-STR的等位基因。作为参考，本发明X染色体MiniSTR分型试剂盒的使用或检测方法如下一、复合扩增反应PCR反应可以采用如下推荐的20.OiaL和10nL两种体积，如果模板DNA加入体积增加或减少，则灭菌纯水也应作相应的减少或增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>复合扩增反应在GeneAmpPCRSystem9700型热循环仪上进行，釆用热启动技术,共循环32轮，热循环参数如下预变性95°C15分钟变性94°Cl分钟■>退火60°C1.5分钟jao个循环延伸72°Cl分钟」变性90°C30秒，退火58°C1.5分钟[22个循环延伸72°Cl分钟J终延伸60°C30分钟保温4°C保持二、复合扩增产物的检测作为参考，可以利用ABI310遗传分析仪(PE,美国)对上述复合扩增过程所得到的PCR扩增产物进行检测分析。用PCR产物0.8uL与内标0.5uL、变性剂Hi-DiTMformamide310.OuL混勾编号，放入自动进样盘。电进样15000v、5s,电泳150Q0v,24min。用DataCollection软件收集数据，Genescan3.7软件分析数据，用X-12kitKazammacro文件在Genotyper3.7软件自动分型。等位基因的辨认通过等位基因分型Ladder比较来确认，窗口范围+/-0.5bp。并用9947和9948(P，ega，Madison,WI)阳性MA校正等位基因ladder,每个基因座中随机抽取2个等位基因测序进一步验证等位基因ladder。本发明一个完整包装试剂盒的各组分的包装量可视具体情况而定，这些都是本领域技术人员所很容易掌握的，作为参考包括可进行200个反应(20jaL)的PCR扩增以及检测所需的全部试剂，分为扩增试剂盒和检测试剂的独立包装。本发明试剂盒，优选适合中国群体遗传分布的12个X-STR基因座并设计MiniSTR引物，理论上达到或超过了德国的BiotXpeArgusX-8试剂盒的个人识别力，结合常染色体、Y染色体和线粒体的遗传标记，可有效解决缺少双亲的姐妹认亲、同父异母的半同胞姐妹认亲、隔代认亲等特殊DM检案。同时还能实现对低至0.05ng/2(^l的DNA模板成功检测，相对于常规商品化STR分型试剂盒具有高灵敏度、对DNA高度降解的检材高检出率的优点，符合法庭科学个人识别的标准。本发明试剂盒也可为民族特有疾病谱提供基础资料。X染色体上携带了300多种疾病相关基因，使用本试剂盒已获得6个民族群体(广东汉族、鞍山岫岩满族、沈阳锡伯族、沈阳朝鲜族、沈阳回族、重庆土家族)X-STR的遗传分布、突变率、连锁平衡14和基因结构变异的研究数据，对相关疾病进行分析和携带者筛查，确定疾病与STR基因座多态性间的遗传关联，进而用X-STR基因座进行疾病的基因定位及分子诊断具有重要的参考价值。此外，本发明也可通过分析12个X-STR在男性群体中的单倍型和单倍型群分布，勾画出X染色体的进化树，加深我国各个民族父系群体间的遗传进化研究。图l本发明试剂盒的扩增原理图。图2GeneScan分型图。图3隔代认亲的案例图。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1本实施例中的试剂盒是针对A、B、C、D四组共12个X染色体STR基因座制作的。由分离包装的引物混合物、DM聚合酶、PCR反应液、内标和等位基因分型标准物Ladder构成。所述引物混合物由A、B、C、D四组12个X-STR基因座的加尾引物对和四对荧光公共引物混合而成，其中，四对荧光公共引物GA和GB、GA和GC、GA和GD、GA和GE中的荧光公共引物GA和GB、GC、GD、GE为GA(5'-GTTTCTT-3')，GB(-Fl-CGGTCGAT-3,)GC(-F2-CCGAATGC-)GD(5'-F3-CGGCTACG-30GE(5'-F4-CTAGATAC-)其中，蓝色荧光标记物FAM的结构式为绿色荧光标记物JOE的结构式为黄色荧光标记物NED的结构式为红色荧光标记物ROX的结构式为所述的12个X-STR基因座STR引物的序列分别为SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29所示。试剂盒中内标由ROX标记的90、120、150、180、210、240、270、300bp扩增产物，乙醇沉淀后混合,调整各片段的量至电泳峰面积相近。作为线性内标(internallanestandard,ILS),与待测样本混合力卩样电泳，使用GeneScanAnalysisSoftware3.7NT软件计算样本产物片段大小。本实施例中的等位基因分型标准物Ladder由A、B、C、D四组12个X-STR基因座中的各个基因座的等位基因分型标准物混合而成。在具体制作时，上述等位基因分型标准物按以下方式制得加尾引物分别扩增各个X染色体STR基因座不同等位基因的个体样本，电泳分离，硝酸银染色，切下各基因座全部等位基因目的片段凝胶；用荧光标记的公共引物分别扩增各基因座的等位基因凝胶浸泡液，PCR产物克隆；DM测序证实插入片段的大小和结构；按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后；混合并调平衡所有的等位基因，使制备出的各个基因座的等位基因分型标准物等量，即各个基因座的等位基因分型标准物的克分子量均相等；上述制备方法均为本领域技术人员所习知。试验例1本发明试剂盒灵敏度检测将9947(女性)DNA(10ng/u1)阳性对照(购自Promega公司)分别稀释为15pg、30pg,50pg,125pg,250pg，500pg,1ng,每个稀释的模板DNA重复10次扩增结果，用于本发明试剂盒的的灵敏度研究。试验结果显示，本发明试剂盒最小DNA检出量为50pg,GeneScan分型图见图2。试验例2本发明试剂盒在广东汉族群体的法医学应用研究群体遗传学研究样本选自潮州、汕头、揭阳地区，遵循"知情同意"原则，随机选取汉族健康无血缘关系个体200名(女性104名，男性96名)，抽取静脉血2mL，EDTA抗凝。<2检验结果表明，各基因座在广东潮汕地区汉族女性群体的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(未列出)。用RxC列联表乂2检验比较各基因座男女之间的等位基因频率，无显著性差异(P〉0.05)，因此合并男女的数据进行总群体等位基因频率的统计，见表2。法医学应用评价参数见表3，12个X-STR基因座具有较高的多态性和个体识别率。17表212个X-STR基因座在广东潮汕地区的遗传多态性数据DXS8378DXS7132DXS卿8DXS6801DXS7424HPRTB等位基因频率等位基因频率等位基因频率等位基因频率等位基因频率等位基因频率90.015120.02570德90.045130細100,020100.275130.1108'.30.025100.215140.085110.105110.300140.300100.035110.445150細120.215]20.365150.320110.220120.225160.185130.335130.035160.215120.515130扁170.265140.145140細170細130.165140.030180.245150.120180.010140.020190.105160.045150.015200.015170.015DXS6800DXS6789DXS6809DXS101DXS8377DXS腿1等位基因频率等位基因频率等位基因频率等位基因频率等位基因频率等位基因频率150.015150.020280細200.015380德300.005160.415160.155290.025210扁39o細310細170.050170.245300.025220.015400.010320.015180.115180.030310.145230.065410.01532.20細190.255190.010320.235240.155420.025330.040200.045200.055330.275250.260430.02033.20.010210.095210.175340.155260.195440.045340扁220.010220.285350.075270.175450.03534.20.005230.015360.045280.065460.055350.035240扁370.010290.035470.09535.20.010480.165360.045490.15536.20.040500.125370.155510.125380.290520.035390.155530扁400.035540.015410扁550.015420.005560.015430駕570德440.035450.005460.030_表312个X-STR基因座的法医学应用评价参数_基因座^S5^5151MECrMEC'h:期望杂合度；PD、女性个人识别力；PDM:男性个人识别力；PIC:多态信息含量;MECT:三联体女儿的平均非父排除率；MECD:二联体女儿的平均非父排除率DXS83780.655±0.0290.8440.6870.597DXS71320.725±0.0300.8760.7280.689DXS68000.741±0扁0.8890.7560.712DXS98980.778±0.0250.8910.7780.743DXS68010.655±0.0320.7990.6870.586DXS68090.812±0.0240,9460.8190.788DXS67890.852±0.027O細0.8230.843DXS1010.898±0.0220.9750.8870.876DXS74240.745±0.0290.8840.7490.726HPRTB0.764±0.0250.9020.7640.742DXS83770.901±0.0200.9760.9120.901DXS100110.921±0.0180.9840.9150.9170.4480.5490.5980.6050.5190.6840.6560.7940.5690.5940.8390.874O扁0.6940.71581190.8750.7120.7380.8960.925349876771880个用PowerPlex16System试剂盒分型不排除亲权关系、孩子为女孩的三联体/二联体家系，本试剂盒中的12个X-STR基因座也均未得出排除父权的结论。在特殊的亲权关系鉴定中，由于X染色体特有的遗传方式，同父所生的姐妹在X-STR基因座上有一个相同的等位基因。一例姐妹认亲的案例中，使用本试剂盒鉴定张三是否与张一、张二存在姐妹关系。从表4可知姐妹俩(张一和张二)12个X-STR基因座中每个基因座至少有l个相同的等位基因。可疑妹妹(张三)与张一之间10个X-STR基因座均无相同等位基因，与张二之间有8个X-STR基因座无相同等位基因，据此可以否定张三与张一和张二存在姐妹关系。Powerplex16system检测15个常染色体STR结果也证实了这一结论，见表5。表4本试剂盒12个X-STR被检人基因分型结果基因座张一张二可疑妹妹(张三)DXS837810—1110-—1111.—12DXS713213—1613-—1614-—15DXS680018—2119-—2117-—20DXS98988.3—148.3.—1413-—15DXS680112—1212-—1310-—14DXS680929—3130-—3130DXS678922—1522-—1522-—18DXS742416—1516-—1514-—20DXS10128—2428-—2426-—18HPRTB12—1312-—1311--14DXS837746—5046-—5147-—51DXS画140—4240—4239—44表5Powerplex16system试剂盒被检人基因分型结果基因座张一张二可疑妹妹(张三)D8S117913—1413—-1414—-15D21S1129—31.230.3—-31.230—-31.2D7S8208—1211—-1211—-12CSF1PO11—1210—-1210—-13D3S135816—1816—-1816~18THOl7—97—-99一9.3D13S3178—118—1110—-12D16S5399一1111—-1212--14D2S133817—2217—-2218——19D19S43314—16.21414——17VWA14—1817—-1814—-16TPOX8—118—119—-10D18S51141H716—-18D5S81810—1111—-1211FGA22—2419—-2419—-22男性的X染色体以单倍型形式遗传给女儿，在图3所示的一例隔代认亲的案例中，需要对王三是否与王一、王二的已故同胞兄弟具有亲缘关系进行鉴定。本试剂盒中的DXS6801、DXS6809、DXS6789位于同一连锁群内，呈连锁遗传，便于以单倍型观察多态性，王三DXS6801、DXS6809、DXS6789的单倍型是13-31-14、12-30-17，与王一单倍型(13-31-22)、王二单倍型(13-33-22)无任一相符，因此可排除父权，此外，DXS8378、DXS7424、DXS10011基因座也直接排除了父权，见表6。_表6本发明试剂盒12个X-STR被检人基因分型结果基因座i^1ZH可疑侄女(王三)JDXS8378111310-—1210-—12DXS7132131314-—1615-—16DXS6800191921-—2221-—22DXS98988.31413-—1413-—14DXS6801131313-—1212-—13DXS6809313331-—3030-—34DXS6789222214-—1717-—19DXS7424161718-—1815-—18DXS101282824-—2724-—26HPRTB141412-—1412-—13DXS8377444445一94548DXS1001136.23839-—4242-—3720序列表序列表<110〉石美森<120>X染色体STR荧光复合扩增试剂盒及其制备方法和应用<130>KLPI08078<160>29<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>7<212>DNA<213>Artifical<400>1gtttxtt7<210>2〈211>8〈212>画<213>Artifical<400〉2cggtcgat8〈210>3〈211>8<212〉DNA〈213>Artifical〈■〉3c.gg组cg8〈210〉4<211〉8〈212〉DNA<213>Artifical<棚〉4cggctacg8〈210>5<211〉8〈212>DNA<213>Artifical<4。0>5ctagatac8<210>6<211>25<212>腿<213>Artifical<400>6gtttxttxttaggcaacccggtggt25<210>7<2U>27<212>隐<213>Artifical<400>7cggtcgatggcgacaagaacgaaact(27<210>8<211>28<212>腿<213>Artifical<400>8gtttcttcgagcacacctacaaaagctg28<210>9<211>28〈212〉DNA<213>Artifical<婦9cggtcgattaggctcacctcactgagca28<210〉10<211>27<212〉DNA<213>Artifical<400〉10gtttcttcacttcatggcttaccacag27<210>11<211>28<212〉DNA<213>Artifical<400>11cggtcgatgacctttggaaagctagtgt28<210>12〈211〉31<212〉腿<213>Artifical<400>12gtttcttctctccagaatagttagatgtagg31<210>13<211>28<212〉DNA<213>Artifical<400>13cggtcgataatacacatccccattcctg28<210>14<211>31<212〉DNA<213>Artifical<400>14gtttcttagtcatttcctctaacaagtctcc31<210〉15<211>31<212>DNA<2I3>Artifical<400>15ccgaatgctccagagagtcagaatcagtagg31<210〉16<211>29<212〉謹<213>Artifical<400>16gtttcttctgcttgagtccaggaattcaa29<210>17<211>31<212〉腿<213>Artifical函〉17ccgaatgcgaacacgcacatttgagaacata31<210>18<211>27<212>腿<213〉Artifical<400>18gtttcttgtgggaccttgtgattgtgt27<210>19〈211>28<212>DNA<213>Artifical<400>19ccgaatgcctggctgacacttagggaaa28<210>20<211〉28<212>DNA<213>Artifical<400〉20gttt.cttctagattatgtaggaatttgg28<210〉21〈211〉28<212〉DNA<213>Artifical<400〉21ccgaatgctctggagaatccaattttgc28<210>22<211>29<212>DM<213〉Artifical<400〉22gtttctttcccctctcatctatctgactg29<210〉23<211>28<212〉DNA<213〉Artifical<德23cggctacgcactcctggtgccaaactct28<210>24<211>30<212>腿<213〉Artifical<400〉24gtttcttactctaaatcagtccaaatatct30<210>2523<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>权利要求1、用于扩增X-STR基因座的公共引物序列，其特征在于其碱基序列分别为SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5所示；其中，在SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和的SEQIDNO5的5/端分别加上颜色互不相同的荧光标记物。2、权利要求1所述的公共引物序列在制备检测X染色体STR分型的试剂中的应用。3、一种X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，包括彼此独立包装的扩增试剂和检测试剂组成，所述的扩增试剂包括引物混合物，DNA聚合酶，PCR反应缓冲液；所述的检测试剂包括内标和等位基因分型标准物Ladder;其特征在于所述的引物混合物由五条公共引物和24条加尾引物混合而成；所述的五条公共引物序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示，其中，在SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5的5'端分别加上颜色互不相同的荧光标记物；所述的24条加尾引物的序列分别为SEQIDN0:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29所示。4、按照权利要求3所述的X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其特征在于所述内标由荧光标记物标记的90、120、150、180、210、240、270、300bp扩增产物组成。5、按照权利要求4所述的X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其特征在于所述荧光标记物是LIZ。6、按照权利要求3所述的X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其特征在于所述等位基因分型标准物Ladder由A、B、C、D四组共12个X-STR基因座的等位基因分型标准物混合而成。7、按照权利要求3所述的X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其特征在于所述的扩增试剂中还进一步包括阳性对照和阴性对照。8、按照权利要求7所述的X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照是9947A女性DNA。9、按照权利要求7所述的X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其特征在于:所述的阴性对照是9948男性DNA。全文摘要本发明公开了一种X染色体MiniSTR分型试剂盒及其制备方法和应用。本发明设计了四对公共引物对，优选了适合中国群体遗传分布的12个X染色体STR基因座并对部分基因座设计了MiniSTR引物，在上述MiniSTR引物的5′端分别加上这四对公共引物得到24条加尾引物；采用本发明试剂盒可在一个单管同时扩增12个X染色体STR基因座，结合常染色体、Y染色体和线粒体的遗传标记，可有效解决缺少双亲的姐妹认亲、同父异母的半同胞姐妹认亲、隔代认亲等特殊DNA检案，同时还能实现对低至0.05ng/20μl的DNA模板成功检测，本发明试剂盒具有高灵敏度、对DNA高度降解的检材高检出率、制备成本低等优点。文档编号C12Q1/68GK101475993SQ20091007680公开日2009年7月8日申请日期2009年1月21日优先权日2009年1月21日发明者雪杨,百茹峰,石美森,丽袁,涤鲁申请人:中国政法大学