专利名称：棉花染色体荧光原位杂交的端粒标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种可用于棉花染色体荧光原位杂交的末端端粒标记及其应用。
背景技术：
DNA荧光原位杂交(FISH)技术是70年代末80年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP )，根据DNA-DNA或DNA-RNA碱基配对原则与染色体上相对应的序列杂交。进行原位杂交时，先用高温或碱处理DNA分子，使之发生变性；当温度下降或pH值恢复到中性，变性的DNA会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只有它们之间的碱基序列是同源互补或部分同源互补时，才能全部或部分复性，产生分子杂交。由于探针带有荧光物质，因此杂交的位点可直接在荧光显微镜下观察到。利用该技术可以检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分折。
随着技术的发展与不断完善，荧光原位杂交在植物上应用与研究的优越性越来越明显(l)与用放射性物质来标记探针的分子原位杂交相比，它不需要放射性同位素，安全可靠，不需特殊方法处理，检测时间短，背景清晰，检测灵敏度高，底物可长期贮存而不失活；(2)与其它非放射性原位杂交技术相比，它可用不同荧光素标记的探针与同 一 目的DNA进行杂交，即进行多重标记， 一次定位多个DNA序列；(3)杂交信号可逐级放大，进行定量或非定量分析，并且可通过计算机软件图像分析系统检测并处理杂交微弱的信号，使其可视
4化更强。
端粒是位于真核生物线状染色体最外端的DNA序列和蛋白质
的复合结构，端粒在染色体的末端起着"保护帽"的作用，能够防止染色体末端之间的融合，重组和降解。端粒序列是由简单串联重复序列构成的保守序列，其长度是可变的。脊推动物的端粒序列首
先在人类染色体中得到鉴定，由5'-TTAGGG-3'的保守序列构成。第一个植物的端粒序列在模式植物拟南芥中得到分离到，其保守序列为5'-TTTAGGG-3'。已发现拟南芥类型的端粒序列存在于多种植物中。但不是所有的植物都具有拟南芥类型的端粒序列，如一些洋葱属的植物及其相关种中不存在拟南芥类型的端粒序列； 一些植物的端粒甚至被脊推动物类型的端粒序列所取代。另外，在一些植物中发现其端粒序列存在着各种重复序列的变体。到目前为止，还没有关于棉花端粒的相关报道。
直接克隆端粒序列是很困难的，郭歌等(1996)通过染色体微切割，陈守义等(2003 )通过端粒的相关序列都没能克隆到端粒序列。这是因为染色体末端的端粒是由线性DNA分子组成的，通常互相配对的两条DNA中一链中，有一条稍长于另一条，构成了t环结构，t环的存在使得端粒序列难以插入到载体中，因此造成端粒序列克隆的困难。理论上，由于端粒序列(TTTAGGG) n中不含有现有的内切酶识别的位点，因此，通过酶切基因组构建的文库(例如BAC克隆文库) 一般不含有染色末端的端粒序列，所以也无法从这些文库中分离得到端粒序列。采用机械方式随机打断基因组构建的文库要比用限制性内切酶特异切割得到的DNA片段构建的基因组文库更加完整全面，因此这样的文库中可能含有染色体末端的序列。Richard ( 1988 )和Moyzis ( 1990 )便是通过构建随机打断的基因组片段的文库，分别分离到了拟南芥的端粒序列(TTTAGGG)n和人类的端粒(TTAGGG)n序列。但是，构成端粒序列的串联重复序列(TTTAGGG) n也偶然插入到染色体的中间，在拟南芥与水稻的BAC库中都发现了含有部分(TTTAGGG ) n的序列。这为克隆含有端粒序列的片段提供便利。本发明正是通过含有端粒序列的拟南芥3#染色体上的BAC克隆F23H6中(TTTAGGG) n两翼的非重复序列设计引物，克隆到了拟南芥类型的端粒序列，并通过FISH和Southern杂交进行了验证。这为克隆端粒序列提供了 一条新的思路。
发明内容
本发明的目的是为棉花荧光原位杂交提供一种位于染色体最末端的端部标记，通过该端部标记，能够对棉花染色体的长度进行估量，从而为进一步的染色体核型分析及目的信号的染色体定位奠定基础。
本发明的端粒标记序列如序列表SEQ ID No. 1所示，用生物素标记后即可作为单针，与棉花染色体的端粒端部杂交，从而达到标记端粒端部的目的。
上述标记可通过如下方法制得釆用引物对TS1(5'-TGAGGGACTCAC ATACATTG画3') ， TS2(5'-ACC ACTGAACATCC ATTGAG-3')以拟南芥基因组为模板进行PCR扩增，扩增产物通过胶回收纯化后与T-easy载体连接得到含有目的片段的质粒pAT 1 ，并进行测序验证；2)用五coRI酶切pATl,回收目的片段，并进行生物素标记。
用上述端粒标记作为探针，与棉花中期染色体杂交，用安装有CCD摄像头的ZEISS Axioskop2 mot plus荧光显微镜观察荧光信号，用ZEISS —ISIS成像系统软件进行原位杂交图像的摄取、釆集,Photoshop7.0软件进行图版编排。荧光原位杂交的结果显示，在棉花所有染色体的末端都有明亮的杂交信号。
用Bal31(核酸外切酶，它能从染色体的两端开始消化染色体的DNA链)处理基因组DNA，在进行杂交检测，结果表明随着Bal31消化时间的延长，杂交条带的分子量越来越小，信号越来越弱。这说明杂交信号从Ba131消化开始就受到了影响。结合荧光原位杂交 以及Bal31酶切动力实验得结果，证明杂交信号的确实位于染色体 最外端。
本发明方法特别适用于在棉花的荧光原位杂交中作为染色体端 部的标记。用通过本方法得到的端粒序列克隆作为探针进行原位杂 交，杂交信号的强度比使用寡核苷酸或者PCR法得到的端粒序列作 为探针的信号更强烈，更适合于棉花的荧光原位杂交。
将棉花的端部比标记应用于荧光原位杂交中，将可以对棉花的 染色体的长度进行测量，从而对棉花染色体进行核型分析。也可以 在核型分析的基础上，将目的信号定位于相应的染色体上。
图1显示的是实施例1通过PCR得到的端粒序列的电泳图，其 中泳道1为Mark,泳道2 4是扩增产物；
图2是以阿非利加棉根尖中期染色体为靶DNA，生物素标记的 pATl作为探针，进行荧光原位杂交的图片，箭头所示的是杂交信号；
图3显示的是新海7弁棉根尖中期染色体为靶DNA,生物素标记 的pATl作为探针，进行荧光原位杂交的图片，箭头所示的是杂交信 号；
图4是Bal31酶切动力学实验的图片。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。
在本发明中，2xSSC表示的配置为0.3M NaCl, 0.03M C6H5Na307.2H20，其中2x表示浓度的倍数，相应的20xSSC表示的
7配置为3M NaCl， 0. 3M C6H5Na307.2H20。
在本发明中，涉及到的百分号"％",若未特别说明，是指质量 百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有 溶质若干克；液体之间的百分比，是指在2(TC时容量的比例。溶液 未具体指明溶剂的，所用溶剂为水。
在本发明中诸如"3x5分钟洗涤"，表示洗涤3次每次5分钟。
实施例l端粒序列的克隆
通过对NCBI上公布的核酸序列进行搜索，发现一个位于拟南 芥3#染色体上的BAC克隆(F23H6)中含有一段拟南芥类型的端粒序 列。根据该端粒序列两端的非串联重复序列设计 一 对引物 TS1 (5 '-TGAGGGACTCACATACATTG-3') ; TS2(5'-ACCACTGAAC ATCCATTGAG-3')。以拟南芥基因组为模板，进行PCR扩增。PCR 反应的条件为反应体系首先在9fC下变性5min，紧接着执行30 个循环，每个循环由如下反应条件所组成94'C下变性45s，55'C下 退火30s，72'C延伸45s,最后一步是在72匸下延伸5min。 PCR反应 的产物通过胶回收纯化后与T-easy载体连接。得到的含有目的片段 的克隆被命名为pATl， pATl作为端粒序列被应用于以下所有的实 验。pATl的测序结果表明，目的片段长353bp，含有294bp端粒重 复序列，其中(TTTAGGG) n重复42次，其核苷酸序列如SEQID No.l所示。
实施例2 二倍体(2n=2x=26)棉花染色体荧光原位杂交的端粒标 记
材料阿非利加棉(中国农业科学院棉花研究科贸公司)
一、根尖中期染色体的制备
取阿非利加棉种子数十粒，用手术刀切开种子生长点处的种壳，
然后将种子播种于经煮沸消毒的潮湿的细沙中，置25-3(TC萌发。待根长至l-2cm时(约1天半)，取根尖(0.5mm )，于放线菌酮(25ppm) 2(TC预处理(破环纺锤丝，使前期染色体提前浓缩，形成分散的中 期染色体)，春、秋天预处理2h，夏天1.5h,冬天2.5h。预处理结束 后，用蒸馏水洗10min，固定液(95%乙醇冰乙酸3 : 1 )固定2-24h。 然后，水洗10min， 2%纤维素酶(Cellulase R誦IO ) (Sigma)和0.5%果 胶酶(Pectinase )混合液37°C处理30m (分解细胞壁，释放细胞核)， 45%或60%乙酸(软化细胞)压片。镜检，选择分裂相较好和多的 制片保留。-2(TC预冷，-70°<3揭盖片，80。C水洛锅表面迅速烤干(防 止染色体变形)。4'C保存备用。
二、 探针的标记
探针标记试剂盒为德国Roche公司的Bio-Nick Translation标记 系统。为了获得良好的标记效果，在50pL体系中，用10U的五coi I酶消化pATl载体，将端粒序列从质粒pATl上分离，电泳后回收 含有端粒序列的片段，并纯化。标记的步骤如下取纯化后的DNA 片段ljig，用双蒸水稀释至16|iL，加入Biotin-Nick Translation Mix 4jiL,混匀后于15。C反应90min，最后加入0.5M的EDTA lpL终止反 应，-201:保存。
三、 荧光原位杂交的流程
(一)染色体制片的准备
1. 制片在6(TC烘箱中干燥过夜。
2. 用100吗/ml的RNase A (2xSSC配制)加塑膜盖片，包装 于37°C， 1小时。
3. 2xSSC漂去塑膜盖片，2xSSC, 3x5分钟洗涤。
4. 用0.1%Pepsin ( 10mMHCl配制)37°C， 30分钟。
5. PBS， 2x5分钟洗涤。
6. 4。/。的多聚甲醛37。C, IO分钟。
7. 2xSSC， 3x5分钟洗涤。
98. 2xSSC配制70。/。去离子甲酰胺溶液，80°C, 2min。
9. -20。C条件下，用75%、 95%、 100%的乙醇逐级脱水，每级 5分钟。
10. 自然风干，备用。
(二) 杂交混合液的准备 20fil杂交混合液
1. lO(il 100%去离子甲酰胺
2.4^1 50%硫酸葡聚糖(放入37。C溶解后备用)
3. 2^1 20xSSC
4. 1^1 10%SDS (放入37。C溶解后备用)
5. ljLil探针(步骤二标记的探针，浓度50ng/|Lil)
6. 2^1 封阻DNA(片段大小200~ 1000bp,浓度是探针的 35倍)
在涡流混合器上混匀，在PCR仪上97。C变性IO分钟，迅速转 入冰水中2分钟，37°C， lh。
(三) 杂交
1. 取20^d杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装于8(TC水洛 锅中共变性10分钟。
2. 转入37'C水洛中杂交过夜(注意检查封袋有没有进水)。
(四) 洗脱和信号检测
1. 杂交制片用2xSSC漂洗去塑膜盖片。
2. 2xSSC (含有0.1。/。SDS) 37°C, 3x5分钟洗涤。
3. 0.2xSSC (含有0.1%SDS) 37°C， 3 x 5分钟洗涤。
4. 2xSSC室温下冲洗2次，甩干制片。
5. 力口 50(^1 /片5%BSA (水或4 x SSC/Teween20配制)加塑膜 盖片，37t:封阻30分钟。
6. 甩干封阻液(制片不能见干)，力口 30(!l/片Avidin-FITC或Avidin-Fluorescein抗体(工作液浓度10jig/ml),加塑膜盖片，37°C 温育1小时。
7. 1 x PBS/Teween20 ( 1 x PBS, 0.3%Teween20 )中，37°C ， 3 x 5分钟洗涤。
8. 用DAPI (工作液浓度2昭/ml， 1 x PBS配制)30^1 /片衬
染5分钟。
9. lxPBS, 3x3分钟洗去衬染剂，甩干或凉干，用抗荧光衰 减剂(Vectashied)封片。
四、荧光观察
用安装有CCD摄像头的Leica MRA2荧光显微镜观察荧光信 号，用Leica—QFISH成像系统软件进行原位杂交图象的摄取、釆集 和加工，以及分析。结果如图2所示，通过荧光显微镜可以观察到 明亮的杂交信号。
实施例3四倍体(4n=4x=52)棉花染色体荧光原位杂交的端粒标 记
材料四倍体棉新海7# (中国农业科学院棉花研究科贸公司)
一、根尖中斯染色体的制备
取新海7#种子在约6(TC的温水中浸种过夜，播种于经煮沸消毒 的潮湿的细沙中，置25-3(TC萌发。待根长至3-5cm时(约2天半)， 取根尖(0.5mm)，于放线菌酮(25ppm) 2(TC预处理(破环纺锤丝， 使前期染色体提前浓缩，形成分散的中期染色体)，春、秋天预处理 2h,夏天1.5h，冬天2.5h。预处理结東后，用蒸馏水洗10min，固 定液(95%乙醇冰乙酸3 : 1)固定2-24h。然后，水洗10min， 2% 纤维素酶(CellulaseR-lO) (Sigma)和0.5%果胶酶(Pectinase )混合 液37。C处理30m(分解细胞壁，释放细胞核)，45%或60%乙酸(软 化细胞)压片。镜检，选择分裂相较好和多的制片保留。-2(TC预冷,-70°(:揭盖片，8(TC水浴锅表面迅速烤干(防止染色体变形)。4'C保 存备用。
二、 探针的标记
探针标记试剂盒为德国Roche公司的Bio-Nick Translation标记 系统。为了获得良好的标记效果，在5(HU体系中，用10U的Ecor I酶消化pATl载体，将端粒序列从质粒pATl上分离，电泳后回收 含有端粒序列的片段，并纯化。标记的步骤如下取纯化后的DNA 片段l|ig，用双蒸水稀释至16^1,加入Biotin-Nick Translation Mix 4pl， 混匀后于15。C反应90min，最后加入0.5M的EDTAlpl终止反应，-20 'C保存
三、 荧光原位杂交的流程
(一) 染色体制片的准备 制片在6(TC烘箱中干燥过夜。
1. 用100fig/ml的RNase A (2xSSC配制)加塑膜盖片，包 装于37"C, l小时。
2. 2xSSC漂去塑膜盖片，2xSSC, 3x5分钟洗涤。
3. 用0,"/oPepsin ( 10mM HC1配制)37。C , 30分钟。
4. lxPBS, 2x5分钟。
5. 4%的多聚甲醛37°(:， 10分钟。
6. 2xSSC， 3x5分钟洗涤。
7. 2xSSC配制70%去离子甲酰胺溶液，80°C， 2min。
8. -20°。条件下，用75%、 95%、 100%的乙醇逐级脱水，每 级5分钟。
9. 自然风干，备用。
(二) 杂交混合液的准备 20pl杂交混合液
1. 10|^1100%去离子甲酰胺2. 4|il 50%硫酸葡聚糖(放入37。C溶解后备用)
3. 2(il 20xSSC
4. 10%SDS (放入37。C溶解后备用)
5. l^il探针(步骤二标记的探针，浓度50ng/W)
6. 2(il 封阻DNA(片段大小200~ 1000bp,浓度是探针的 35倍)
在涡流混合器上混匀，在PCR仪上97匸变性IO分钟，迅速转 入冰水中2分钟，37°C， lh。
(三) 杂交
1. 取20)al杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装于8(TC水洛 锅中共变性IO分钟。
2. 转入37匸水洛中杂交过夜(注意检查封袋有没有进水)。
(四) 洗脱和信号检测
1. 杂交制片用2xSSC漂洗去塑膜盖片。
2. 2x SSC (含有0.1%SDS) 37°C, 3x5分钟洗涤。
3. 0.2xSSC (含有0.1%SDS) 37°C, 3x5分钟洗涤。
4. 2xSSC室温下冲洗2次，甩干制片。
5. 力P 50|al /片5%BSA (水或4 x SSC/Teween20配制)加塑膜 盖片，37'C封阻30分钟。
6. 甩干封阻液(制片不能见干)，力口 30ul/片Avidin-FITC或 Avidin-Fluorescein抗体(工作液浓度10ug/ml),加塑膜盖片，37°C 温育1小时。
7. 1 x PBS/Teween20中，37°C ， 3x5分钟洗涤。
8. 用PI(碘化丙啶)(工作液浓度2jig/ml， 1 x PBS配制)30^1 / 片衬染3-7分钟。9. lxPBS， 3x3分钟洗去衬染剂，甩干或凉干， 用抗荧光衰减剂(Vectashied)封片。
4,荧光观察
13用安装有CCD摄像头的Leica MRA2荧光显微镜观察荧光信 号，用Leica— QFISH成像系统软件进行原位杂交图象的摄取、釆 集和加工，以及分析。结果如图3所示，通过荧光显微镜可以观察 到明亮的杂交信号。
实施例4通过Bal31酶切动力实验验证FISH信号
荧光原位杂能够证明杂交的信号位于染色体的末端，但不能证 明该信号位于染色体的最外端。本发明釆用了 Bal31酶切动力实验 来检测杂交信号是否位于染色体的最外端。Bal31酶是一种核酸外切 酶，它能从染色体的两端开始消化染色体的DNA链。如果杂交信号不是位于染色体的最外端，那么从Bal31消化开始，就不会爱莫能助到酶消化的影响。
试验方法取新海7#的基因组DNA100昭，在30 W体系中分 别用20U的Bal31消化0min, 10min, 20min, 40min, 80min，加入EDTA 至终浓度20mM以中止反应。用酴氯仿抽提后，再分别加入10U的 HaeIII消化基因组DNA,最后将消化的基因组DNA转移到带正电的 尼龙膜上，用DIG标记的pATl作为探针与之进行Southern杂交。
结果如图4所示，随着Bal31消化时间的延长，杂交条带的分 子量越来越小，信号越来越弱。这说明杂交信号从Bal31消化开始 就受到了影响。结合荧光原位杂交以及Ba131酶切动力实验得结果， 证明杂交信号的确实位于染色体最外端。序列表
<110>中国农业科学院棉花研究所
〈120>棉花染色体炎光原位杂交的端粒标记及其应用
<130> KHP08112212.7
<160〉 3
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 353
<212〉 DNA
<213> AraWc/cp57.s t力ah.3朋
<400> 1
tgagggactcacatacattgagtttagggtttagggtttagggtttagggtttagggttt60
agggtttagggtttagggttggtttagggtttaaggtttagggtt哪gt120
ttagggtttagggtttsgggtttagggtttgtttagggtttagggtttag180
ggtttagggtttagggtttagggtttagggtttagggttt郷gtttagggttt兆ggU240
t鄉gttt3gggtttagggtttagggtttagggtttagggtttagggtttagggtttagg300
gtUagggtttagggttagggttcttgacgatg犯cagtggta353
<210〉 2 <211〉 20 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 2
tgagggactc acatacattg
20
<210〉 3 <211> 20 <212>腿 〈213>人工序列 <400> 3
accactgaac atccattgag
20
1权利要求
1、棉花染色体荧光原位杂交的端粒标记，其为生物素标记的SEQ ID No.1所示的序列。
2、 一种制备权利要求l所述端粒标记的方法，包括如下步骤1) 采用引物TSl: 5'-TGAGGGACTCACATACATTG-3', TS2: 5'-ACCACTGAACATCCATTGAG-3'以拟南芥基因组为模板进行 PCR扩增，扩增产物通过胶回收纯化后与T-easy载体连接得到质粒 pATl，并进行测序验证；2) 用五coRI酶切pATl，回收目的片段，并进行生物素标记。
3、 如权利要求1所述的端粒标记在棉花染色体荧光原位杂交中 的应用。
4、 一种棉花染色体荧光原位杂交端粒标记方法，其使用权利要 求1所述的端粒标记作为探针与棉花染色体杂交。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述棉花染色体为根尖中期细胞染色体。
6、 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1) 制备根尖染色体取棉花根尖，于25ppm的放线菌酮中2(TC预处理1.5 2.5小时， 预处理结束后，用蒸馏水洗10min，固定液固定2-24h;水洗10min, 2%纤维素酶和0.5%果胶酶混合液37。C处理30min, 45%~60%乙酸 压片，镜检，选择分裂相较好的制片，-2(TC预冷，-70°(:揭盖片，80 'C水洛锅表面迅速烤干，4'C保存备用；2) 预处理染色体制片将步骤1 )的制片在60。C烘箱中干燥过夜，用100吗/ml的RNase A加塑膜盖片，包装于37'C， l小时；2xSSC漂去塑膜盖片，2x SSC，洗涤3次，每次5分钟；用0.1% Pepsin37。C处理20-40分钟;PBS，洗涤2次，每次5分钟；4。/。的多聚甲醛37'C处理IO分钟；2 x SSC，洗涤3次每次5分钟；2 x SSC配制70%去离子甲酰胺溶液， 80°C， 2min; -20。C条件下，依次用75%、 95%和100%的乙醇逐级 脱水，每级5分钟；最后自然风干，备用；3) 配置杂交液 20pl杂交混合液的配置如下10)ul 100%去离子甲酰胺 4|Lil 50%硫酸葡聚糖 2^1 20 x SSC 1^1 10%SDS探针权利要求1所述的端粒标记探针，浓度10 100ng/ial 2|il封阻DNA，片段大小200~1000bp,浓度是探针的10-60倍 在涡流混合器上混匀，在PCR仪上97匸变性IO分钟，迅速转 入冰水中2分钟，37°C， lh;4) 杂交取20pl杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装于8(TC水浴锅中 共变性10分钟；转入37'C水洛中杂交过夜；5) 洗脱和信号检测杂交制片用2xSSC漂洗去塑膜盖片；用含0.1。/。SDS的2 x SSC 在37'C下洗涤3次，每次5分钟；用含0.1%SDS的0.2 x SSC洗涤 3次，每次5分钟；用2xSSC室温下冲洗2次，甩干制片；加 /片5。/。BSA加塑膜盖片，37'C封阻30分钟；甩干封阻液，加30^1/ 片Avidin-FITC或Avidin-Fluorescein抗体，加塑膜盖片，37。C温育1 小时；用含0.3% Teween20的PBS，于37。C,洗涤3次，每次5分 钟；用PI或用DAPI30ial/片衬染3-7分钟；PBS洗涤3次，每次3 分钟洗去衬染剂，甩干或凉干，用抗荧光衰减剂封片。
全文摘要
本发明提供了一种适用于棉花荧光原位杂交的端粒标记，其为生物素标记的SEQ ID No.1所示的序列。以该端粒标记作为探针与棉花根尖体细胞中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，在染色体的末端都有较强烈的杂交信号。进一步通过实验证实了原位杂交的信号位于染色体的最末端，即杂交信号为端粒信号。因此，通过这种位于染色体末端的端粒标记，就能够对棉花体细胞中期染色体的长度进行估量，从而为进一步的核型分析等细胞学实验奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK101475992SQ20091007674
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者键 凌, 方 刘, 宋国立, 张香娣, 王坤波, 王春英, 王玉红, 黎绍惠 申请人:中国农业科学院棉花研究所