专利名称：识别端粒DNA片段与c-kit基因启动子DNA片段的方法
技术领域：
本发明涉及一种识别端粒DNA片段与C-kit基因启动子DNA片段的方法。
背景技术：
最常见的DNA是由两条互补链通过碱基配对的方式所形成的双链螺旋结构。然 而，某些含有大量鸟嘌呤(G)碱基重复序列的DNA可以通过G碱基间Hoogsteen氢键形成 四链螺旋结构，因此被称为G-四链体(简称G4)。人们发现在染色体端粒末端以及一些重 要的肿瘤基因转录调节区，在一定条件下都能形成G-四链体。研究表明，85-90%恶性肿瘤的发病都与端粒酶的活性有关，而于端粒区域形成的 G4结构可以有效抑制端粒酶的活性，进而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。它由一段双链重 复区域和一段单链重复区域构成，为含有多个GGG重复单元的DNA片段。除了端粒，在生物体的基因组内还有许多重要的DNA片段能够在特定条件下形成 G4结构。例如某些癌基因及抑癌基因的启动子区域都含有富含鸟嘌呤的碱基序列，能够在 特定条件下形成G4结构。其中，位于原癌基因c-kit启动子的基因片段(见序列表的序列 4)，在特定的条件下能够形成一种特殊的平行结构G4。由于其结构涉及c-kit基因表达的 调控而备受关注。因此，识别端粒DNA片段与c-kit基因启动子DNA片段对于肿瘤诊断治疗以及抗 肿瘤药物的研发有着非常重要的意义。物碱。
氯化两面针碱的结构见式(I)，血根碱的结构见式(II)，两者均为四苯菲啶类生式(I)
发明内容
本发明的目的是提供一种识别端粒DNA片段与c-kit基因启动子DNA片段的方法。本发明提供的识别待测DNA为端粒DNA片段还是c_kit基因启动子DNA片段的方 法，包括如下步骤将待测DNA分别与氯化两面针碱或血根碱进行反应；如果待测DNA与氯化两面针 碱反应后由单链结构转变为混合G4结构，与血根碱反应后由单链结构转变为反平行G4结 构，则待测DNA为端粒DNA片段；如果待测DNA与氯化两面针碱反应后由单链结构转变为平行G4结构，与血根碱反应后单链结构不变，则待测DNA为c-kit基因启动子DNA片段；所述 混合G4结构为平行G4结构和反平行G4结构的混合结构。所述待测DNA与所述氯化两面针碱的物质的量的比值可为1 (8-50)；所述待测 DNA与所述血根碱的物质的量的比值可为1 (1-50)。所述待测DNA与所述氯化两面针碱的物质的量的比值具体可为1 12;所述待测 DNA与所述血根碱的物质的量的比值具体可为1 12。所述待测DNA与所述氯化两面针碱的反应可在pH值为6. 0 8. 0的缓冲溶液中 进行；所述待测DNA与所述血根碱的反应可在pH值为6. 0 8. 0的缓冲溶液中进行。所述缓冲溶液具体可为浓度为4-40mM的Tris缓冲溶液，优选浓度为10_40mM的 Tris缓冲溶液，如浓度为IOmM的Tris缓冲溶液。在上述两个反应体系中，反应起始时，所述待测DNA在所述缓冲溶液中的浓度为 1-5 μ M，优选为 4 μ M。所述反应的时间为1小时以上，优选为12小时。所述方法中，检测待测DNA的结构变化的方法可为以测定旋光性为基础的分析方 法，具体可为圆二色谱法。所述端粒DNA片段可为含有四个以上GGG重复单元的DNA片段。所述端粒DNA片段具体可为序列表的序列1或序列表的序列2或序列表的序列3 所示的DNA片段；所述c-kit基因启动子DNA片段具体可为序列表的序列4所示的DNA片 段。应用圆二色谱法检测DNA的结构变化的判断标准如下如果出现256nm左右的信 号，反应后的溶液中含有单链DNA ；如果出现265 275nm的信号，反应后的溶液中含有平 行G4结构的DNA ；如果出现288 298nm的信号，反应后的溶液中含有反平行G4结构的 DNA。与现有技术相比，本发明提供的方法具有如下优点能够非常有效的识别端粒 DNA片段与c-kit基因启动子DNA片段；只要按本发明提供的比例将化合物与DNA混合，就 能实现，且不需要繁琐的后处理，该方法简便易行，实验条件温和。
图1为实施例1中氯化两面针碱与HT4反应的圆二色谱。 图2为实施例2中氯化两面针碱与H22反应的圆二色谱。 图3为实施例3中氯化两面针碱与H24A反应的圆二色谱。 图4为实施例4中氯化两面针碱与C23反应的圆二色谱。 图5为实施例5中血根碱与HT4反应的圆二色谱。 图6为实施例6中血根碱与H22反应的圆二色谱。 图7为实施例7中血根碱与H24A反应的圆二色谱。 图8为实施例8中血根碱与C23反应的圆二色谱。 图9为实施例9中氯化两面针碱与HT4反应的圆二色谱。 图10为实施例10中氯化两面针碱与HT4反应的圆二色谱。 图11为实施例11中血根碱与HT4反应的圆二色谱。
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图12为实施例12中血根碱与HT4反应的圆二色谱。图13为实施例13中氯化两面针碱与C23反应的圆二色谱。图14为实施例14中氯化两面针碱与C23反应的圆二色谱。图15为实施例15中血根碱与C23反应的圆二色谱。图16为实施例16中血根碱与C23反应的圆二色谱。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。实施例中所用的DNA序列(均为人工合成并经过测序鉴定)如下端粒DNA片段HT4 :5，-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3，(序列表的序列 1)。H22 :5，-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3，(序列表的序列 2)。H24A :5，-TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGA-3，(序列表的序列 3)。c-kit基因启动子DNA片段C23 :5，-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3，(序列表的序列 4)。氯化两面针碱成都思科华有限公司，纯度为98%。血根碱成都思科华有限公司，纯度为98 %。实施例中均采用浓度为IOmM的Tris缓冲溶液。实施例1、应用氯化两面针碱识别HT4序列溶液A 将氯化两面针碱加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液B 将ΗΤ4加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 7. 4)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化两面针碱与ΗΤ4的摩尔浓度比为12 1)；再用Tris 缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应12小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应 12小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图1。第二组Ep管中的溶液只有单链 DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了平行G4结构的信号(265 275nm)和反平 行G4结构的信号(288 298nm)，氯化两面针碱也在HT4的作用下，产生旋光性，在374nm 和416nm处分别出现信号。结果表明在氯化两面针碱的作用下，HT4由单链结构转变为混 合G4结构。实施例2、应用氯化两面针碱识别H22序列溶液A 将氯化两面针碱加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液B 将Η22加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 7. 4)。
第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液A，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化两面针碱与Η22的摩尔浓度比为12 1)；再用Tris 缓冲溶液将混合液稀释到Η22的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应12小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到Η22的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应 12小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图2。第二组Ep管中的溶液只有单链 DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了平行G4结构的信号(265 275nm)和反平 行G4结构的信号(288 298nm)。结果表明在氯化两面针碱的作用下，H22由单链结构转 变为混合G4结构。实施例3、应用氯化两面针碱识别H24A序列溶液A 将氯化两面针碱加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液B 将Η24Α加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 7. 4)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化两面针碱与Η24Α的摩尔浓度比为12 1)；再用Tris 缓冲溶液将混合液稀释到Η24Α的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应12小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到Η24Α的浓度为4μ M ；摇勻后，反应 12小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图3。第二组Ep管中的溶液只有单 链DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了平行G4结构的信号(265 275nm)和 反平行G4结构的信号(288 298nm)，同时氯化两面针碱也在H24A的作用下，产生旋光性， 在372nm和416nm处分别出现强信号。结果表明在氯化两面针碱的作用下，H24A由单链 结构转变为混合G4结构。实施例4、应用氯化两面针碱识别C23序列溶液A 将氯化两面针碱加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液B 将C23加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 7. 4)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化两面针碱与C23的摩尔浓度比为12 1)；再用Tris 缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应12小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应 12小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图4。第二组Ep管中的溶液只有单 链DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了平行G4结构的信号(265 275nm)，同 时氯化两面针碱也在C23的作用下，产生旋光性，在334nm和397nm处分别出现强信号。结 果表明在氯化两面针碱的作用下，C23由单链结构转变为平行G4结构。
实施例5、应用血根碱识别HT4序列溶液A 将血根碱加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液B 将HT4加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 7. 4)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根碱与ΗΤ4的摩尔浓度比为12 1)；再用Tris缓冲溶 液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应12小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应 12小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图5。第二组Ep管中的溶液只有单链 DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了反平行G4结构的信号(288 298nm)。结 果表明在血根碱的作用下，HT4由单链结构转变为反平行G4结构。实施例6、应用血根碱识别H22序列溶液A 将血根碱加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0 μ M。溶液B 将Η22加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 7. 4)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根碱与Η22的摩尔浓度比为12 1)；再用Tris缓冲溶 液将混合液稀释到Η22的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应12小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到Η22的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应 12小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图6。第二组Ep管中的溶液只有单链 DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了反平行G4结构的信号(288 298nm)。结 果表明在血根碱的作用下，H22由单链结构转变为反平行G4结构。实施例7、应用血根碱识别H24A序列溶液A 将血根碱加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0 μ M。溶液B 将Η24Α加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 7. 4)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根碱与Η24Α的摩尔浓度比为12 1)；再用Tris缓冲 溶液将混合液稀释到Η24Α的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应12小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到Η24Α的浓度为4μ M ；摇勻后，反应 12小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图7。第二组Ep管中的溶液只有单链 DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了反平行G4结构的信号(288 298nm)。结 果表明在血根碱的作用下，H24A由单链结构转变为反平行G4结构。
实施例8、应用血根碱识别C23序列溶液A 将血根碱加入Tris缓冲溶液(pH 7. 4)中，使其终浓度为50. 0 μ M。溶液B 将C23加入Tris缓冲溶液(pH 7.4)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 7. 4)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根碱与C23的摩尔浓度比为12 1)；再用Tris缓冲溶 液将混合液稀释到C23的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应12小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为4 μ M ；摇勻后，反应 12小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图8。第二组Ep管中的溶液只有单链 DNA信号(256nm)；第二组Ep管中的溶液只有单链DNA信号(256nm)，没有其它DNA信号产 生。结果表明在血根碱的作用下，C23结构不发生变化。实施例9、应用氯化两面针碱识别HT4序列溶液A 将氯化两面针碱加入Tris缓冲溶液(pH 8. 0)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液B 将ΗΤ4加入Tris缓冲溶液(pH 8. 0)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 8. 0)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化两面针碱与ΗΤ4的摩尔浓度比为50 1)；再用Tris 缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为1 μ M ；摇勻后，反应18小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为1 μ M ；摇勻后，反应 18小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图9。第二组Ep管中的溶液只有单链 DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了平行G4结构的信号(265 275nm)和反平 行G4结构的信号(288 298nm)。结果表明在氯化两面针碱的作用下，HT4由单链结构转 变为混合G4结构。实施例10、应用氯化两面针碱识别HT4序列溶液A 将氯化两面针碱加入Tris缓冲溶液(pH 6.0)中，使其终浓度为50. 0 μ M。溶液B 将ΗΤ4加入Tris缓冲溶液(pH 6.0)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 6. 0)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入800 μ 1溶液Α，然后加入100 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化两面针碱与ΗΤ4的摩尔浓度比为8 1)；再用Tris 缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为5 μ M ；摇勻后，反应1小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入800 μ 1溶液C，然后加入100 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为5 μ M ；摇勻后，反应 1小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图10。第二组Ep管中的溶液只有单 链DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了平行G4结构的信号(265 275nm)和反平行G4结构的信号(288 298nm)。结果表明在氯化两面针碱的作用下，HT4由单链结 构转变为混合G4结构。实施例11、应用血根碱识别HT4序列溶液A 将血根碱加入Tris缓冲溶液(pH 8. 0)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液B 将ΗΤ4加入Tris缓冲溶液(pH 8. 0)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 8. 0)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根碱与ΗΤ4的摩尔浓度比为50 1)；再用Tris缓冲溶 液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为1 μ M ；摇勻后，反应18小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为1 μ M ；摇勻后，反应 18小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图11。第二组Ep管中的溶液只有单 链DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了反平行G4结构的信号(288 298nm)。 结果表明在血根碱的作用下，HT4由单链结构转变为反平行G4结构。实施例12、应用血根碱识别HT4序列溶液A 将血根碱加入Tris缓冲溶液(pH 6. 0)中，使其终浓度为50. 0 μ M。溶液B 将ΗΤ4加入Tris缓冲溶液(pH 6. 0)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 6. 0)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入1000 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根碱与ΗΤ4的摩尔浓度比为1 1)；再用Tris缓冲溶 液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为5 μ M ；摇勻后，反应1小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入1000 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到ΗΤ4的浓度为5 μ M ；摇勻后，反应 1小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图12。第二组Ep管中的溶液只有单 链DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了反平行G4结构的信号(288 298nm)。 结果表明在血根碱的作用下，HT4由单链结构转变为反平行G4结构。实施例13、应用氯化两面针碱识别C23序列溶液A 将氯化两面针碱加入Tris缓冲溶液(pH 8. 0)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液B 将C23加入Tris缓冲溶液(pH 8. 0)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 8. 0)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化两面针碱与C23的摩尔浓度比为50 1)；再用Tris 缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为1 μ M ；摇勻后，反应18小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为1 μ M ；摇勻后，反应 18小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图13。第二组Ep管中的溶液只有单
9链DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了平行G4结构的信号(265 275nm)，同 时氯化两面针碱也在C23的作用下，产生旋光性，在334nm和397nm处分别出现强信号。结 果表明在氯化两面针碱的作用下，C23由单链结构转变为平行G4结构。实施例14、应用氯化两面针碱识别C23序列溶液A 将氯化两面针碱加入Tris缓冲溶液(pH 6. 0)中，使其终浓度为50. 0 μ Μ。溶液B 将C23加入Tris缓冲溶液(pH 6. 0)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 6. 0)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入800 μ 1溶液Α，然后加入100 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化两面针碱与C23的摩尔浓度比为8 1)；再用Tris 缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为5 μ M ；摇勻后，反应1小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入800 μ 1溶液C，然后加入100 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为5 μ M ；摇勻后，反应 1小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图14。第二组Ep管中的溶液只有单 链DNA信号(256nm)；第一组Ep管中的溶液出现了平行G4结构的信号(265 275nm)，同 时氯化两面针碱也在C23的作用下，产生旋光性，在334nm和397nm处分别出现强信号。结 果表明在氯化两面针碱的作用下，C23由单链结构转变为平行G4结构。实施例15、应用血根碱识别C23序列溶液A 将血根碱加入Tris缓冲溶液(pH 8. 0)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液B 将C23加入Tris缓冲溶液(pH 8. 0)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 8. 0)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液A，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根碱与C23的摩尔浓度比为50 1)；再用Tri s缓冲 溶液将混合液稀释到C23的浓度为1 μ M ；摇勻后，反应18小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为1 μ M ；摇勻后，反应 18小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图15。第二组Ep管中的溶液只有单 链DNA信号(256nm)；第二组Ep管中的溶液只有单链DNA信号(256nm)，没有其它DNA信号 产生。结果表明在血根碱的作用下，C23结构不发生变化。实施例16、应用血根碱识别C23序列溶液A 将血根碱加入Tris缓冲溶液(pH 6. 0)中，使其终浓度为50. 0 μ M。溶液B 将C23加入Tris缓冲溶液(pH 6. 0)中，使其终浓度为50. 0μΜο溶液C =Tris 缓冲溶液(pH 6. 0)。第一组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入1000 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根碱与C23的摩尔浓度比为1 1)；再用Tris缓冲溶 液将混合液稀释到C23的浓度为5 μ M ；摇勻后，反应1小时。第二组Ep管(设置三个重复)在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入1000 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris缓冲溶液将混合液稀释到C23的浓度为5 μ M ；摇勻后，反应
101小时。分别将两组Ep管进行圆二色谱分析，结果见图16。第二组Ep管中的溶液只有单 链DNA信号(256nm)；第二组Ep管中的溶液只有单链DNA信号(256nm)，没有其它DNA信号 产生。结果表明在血根碱的作用下，C23结构不发生变化。序列表<110>中国科学院化学研究所<120>识别端粒DNA片段与c_kit基因启动子DNA片段的方法<130>CGGNARY92369<160>4<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1ttagggttag ggttagggtt aggg 24<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2agggttaggg ttagggttag gg 22<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3ttgggttagg gttagggtta ggga 24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>
<400>4agggagggcg ctgggaggag gg 2权利要求
一种识别待测DNA为端粒DNA片段还是c kit基因启动子DNA片段的方法，包括如下步骤将待测DNA分别与氯化两面针碱或血根碱进行反应；如果待测DNA与氯化两面针碱反应后由单链结构转变为混合G4结构，与血根碱反应后由单链结构转变为反平行G4结构，则待测DNA为端粒DNA片段；如果待测DNA与氯化两面针碱反应后由单链结构转变为平行G4结构，与血根碱反应后单链结构不变，则待测DNA为c kit基因启动子DNA片段；所述混合G4结构为平行G4结构和反平行G4结构的混合结构。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测DNA与所述氯化两面针碱的物质 的量的比值为1 (8-50)；所述待测DNA与所述血根碱的物质的量的比值为1 (1-50)。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述待测DNA与所述氯化两面针碱的物质 的量的比值为1 12;所述待测DNA与所述血根碱的物质的量的比值为1 12。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述待测DNA与所述氯化两面 针碱的反应是在PH值为6. 0 8. 0的缓冲溶液中进行的；所述待测DNA与所述血根碱的反 应是在PH值为6. 0 8. 0的缓冲溶液中进行的。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，反应起始时，所述待测DNA在 所述缓冲溶液中的浓度为1-5 μ M，优选为4 μ M。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述反应的时间为1小时以上， 优选为12小时。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，检测待测DNA的结 构变化的方法为以测定旋光性为基础的分析方法。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于检测所述待测DNA的结构变化的方法为圆二色谱法。
9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述端粒DNA片段为含有四个 以上GGG重复单元的DNA片段。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述端粒DNA片段为序列表的序列1或序 列表的序列2或序列表的序列3所示的DNA片段；所述c-kit基因启动子DNA片段为序列 表的序列4所示的DNA片段。
全文摘要
本发明公开了一种识别端粒DNA片段与c-kit基因启动子DNA片段的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将待测DNA分别与氯化两面针碱或血根碱进行反应；如果待测DNA与氯化两面针碱反应后由单链结构转变为混合G4结构，与血根碱反应后由单链结构转变为反平行G4结构，则待测DNA为端粒DNA片段；如果待测DNA与氯化两面针碱反应后由单链结构转变为平行G4结构，与血根碱反应后单链结构不变，则待测DNA为c-kit基因启动子DNA片段。与现有技术相比，本发明提供的方法具有如下优点能够非常有效的识别端粒DNA片段与c-kit基因启动子DNA片段；只要按本发明提供的比例将化合物与DNA溶液混合，就能实现，且不需要繁琐的后处理，该方法简便易行，实验条件温和。
文档编号C12Q1/68GK101935689SQ20091008840
公开日2011年1月5日 申请日期2009年6月29日 优先权日2009年6月29日
发明者向俊锋, 唐亚林, 杨千帆, 杨舒 申请人:中国科学院化学研究所