纤维素酶酶活促进剂及其制备方法

专利名称：：纤维素酶酶活促进剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种提高酶活力的促进剂，尤其涉及一种纤维素酶酶活促进剂，本发明还涉及该纤维素酶酶活促进剂的制备方法，属于酶工程领域。
背景技术：
：纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，它广泛而大量的存在于自然界，是地球上最大量的可再生性碳源物质。据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55x1091,其中有80%尚未被利用或未被合理利用。植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。纤维素酶是降解纤维素生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。纤维素酶用途极广，其研究及其应用进展较快。目前已在饲料、食品加工、酿造、纺织、环保、造纸、石油开采等行业广泛应用。但如何提高国产纤维素酶的活力，仍然是纤维素酶生产和应用领域非常关注的问题。
发明内容本发明的目的之一是提供一种可显著提高纤维素酶活力的促进剂；本发明的目的之二是提供一种制备上述纤维素酶酶活促进剂的方法；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种纤维素酶酶活促进剂，包括以下彼此独立的各组分组成生化黄腐酸水溶液，Cc^+水溶液、Al"水溶液和Fe^水溶液；为了达到更好的效果，优选的，各组分的浓度为生化黄腐酸lxl(^-lxl(rSg/L,Co2+1x10"-1x10-5mol/L,Al3+lxlO"-lxl(T7mol/L,Fe3+lxlO"-lxl(T7mol/L;更优选的，各组分的浓度为生化黄腐酸lxl(T5g/L,Co2+lxl(T4mol/L,Al3+1x10-3mol/L,Fe3+1x10-2mol/L。生化黄腐酸(BFA):是利用4直物源和专用纟鼓生物菌，经深度发酵和生化处理后，所获得的类似煤黄腐酸和土壤中的富里酸物质。生化黄腐酸含有低分子的芳香羧酸化合物。富里酸是一类低分子的有机酸，可溶于水并溶于酸，在二价盐溶液中不絮凝沉淀，类似煤资源中的黄腐酸。生化黄腐酸是黄腐酸的一个分支，而黄腐酸又是腐殖酸的一个分支。本发明所述生化黄腐酸的主要成份如下黄腐酸(即富里酸)20-80%、氨基酸5-10%、N、P、K及中孩i量元素(Ca、Mg、Fe、S、Zn等)25%、水不溶物<3%、pH4-5。生化黄腐酸在市场上有售，例如上海通微生物技术有限公司，江西萍乡市佳乐腐植酸化工有限^^司，江西省萍乡市科达新技术研究所等；凡从市场上购买得到的生化黄腐酸只要其主要成分符合上述要求都可用于本发明，均能达到本发明的技术效果。本发明中所述的0)2+、A产或Fe^可以各种无机盐的形式存在，例如，可以是氯化钴、氯化铝、硫酸铝，氯化铁、硫酸铁等形式存在，这都不影响本发明的效果。本发明的另外一个目的是提供一种制备上述纤维素酶酶活促进剂的方法；一种制备上述纤维素酶酶活促进剂的方法，包括(1)将生化黄腐酸用蒸馏水溶解，滤纸过滤，收集滤液，得到生化黄腐酸水溶液；(2)将Co"、AlS+和Fe"分别溶于水中，分别得到Co"水溶液、A产水溶液和Fe"水溶液；(3)将步骤(1)和步骤(2)所得到的水溶液分别包装，即得。优选的，步骤(1)中将生化黄腐酸用蒸馏水溶解后调整其浓度为3%(W/W);实验证明，本发明纤维素酶酶活促进剂可提高纤维素酶活力达70%以上，对纤维素酶酶活的促进具有一定的普遍适用性，在纺织、环保、造纸等纤维素酶应用领域具有广泛应用前景。作为参考，本发明纤维素酶酶活促进剂的使用方法和用量为需要用纤维素酶进行酶促反应时，直接将本发明纤维素酶酶活促进剂加入到酶促反应体系中，每一酶活单位的纤维素酶可加入本发明纤维素酶酶活促进剂的用量可以是生化黄腐酸溶液3.8xl(T6ml,0)2+水溶液1.9x10-7mol/L、A产水溶液:1.9xl(T6mol/L，Fe"水溶液:1.9x10-5mol/L。图1本发明纤维素酶酶活促进剂对纤维素酶酶促反应温度的影响；图中的上方位的曲线为加了本发明促进剂后的反应曲线；下方位的曲线为未加本发明促进剂后的反应曲线。图2本发明纤维素酶酶活促进剂对纤维素酶酶促反应pH值的影响；图中的上方位的曲线为加了本发明促进剂后的反应曲线；下方位的曲线为未加本发明促进剂后的反应曲线。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验例1l.材料与方法1.1主要设备离心机LX3-64-01型恒温水浴振荡器SHY-2A型电热恒温水浴箱HH丄S-214型分光光度计721型烘箱DS-206电热鼓风干烘箱pH计PH-250型1.2主要实验材料1.2.1酶纤维素酶l(山东泰安市食品酿造厂固体酶)、纤维素酶2(天津利华酶制剂厂固体酶)1.2.2促进剂制备试验材料生化黄腐酸(购于上海通微生物技术有限公司，其商品名称为"生化黄腐酸")、氯化钴、氯化铝、氯化4^、氯化锌；1.2.3其它材料北京新华滤纸，苯酚，盐酸，杵檬酸，氬氧化钠，无水葡萄糖，磷酸氢二钠，无水亚硫酸钠，酒石酸钾钠，3,5-二硝基水杨酸(均为分析纯级)；1.3主要试剂的配制1.3.1柠檬酸-磷酸氢二钠緩冲液甲液0.2M磷酸氢二钠；乙液0.1M柠檬酸。根踞需要取一定量的曱、乙液混合均匀,用pH计标定.1.3.23,5—二硝基水杨酸DNS显色液精称6.3000gDNS溶于2.0mol/L的NaOH溶液262ml中，加入酒石酸钾钠热溶液(182g酒石酸钾钠完全定溶到500ml水中),再加入5g苯酚和5g无水亚硫酸钠搅拌溶解,冷却后,定溶至1000ml.至于棕色瓶中备用.(72小时后即可使用)1.3.3纤维素酶液的配制测定出固体纤维素酶的水分含量，精称相当于干燥的纤维素酶lg,加入40.0ml蒸馏水,30。C水浴浸提1小时,然后以3000转/分离心10分钟,取上清液，低温保存.待用(酶液的使用期限为7天)。1.3.4促进剂的制备1.3.4.1生化黄腐酸溶液的制备取一定量生化黄腐酸，按3%浓度用蒸馏水溶解，双层中速滤纸干过滤，弃初滤液，收集滤液于棕色试剂瓶中，按此法制备的溶液，有效成分浓度一般在5g/L左右。1.3.4.2促进离子溶液的制备分别取氯化钴(促进离子1号)、氯化铝(促进离子2号)、氯化铁(促进离子3号)、氯化锌(促进离子4号)固体，溶解于蒸馏水配成溶液备用。1.4酶活测定方法1.4.1基本原理滤纸经纤维素酶作用后,生成还原糖,可与3,5-二硝基水杨酸(DNS)生成红色络合物，用比色法测定还原糖的量，即可确定纤维素酶的活力。1.4.2测定方法0.5mL适当稀释的酶液及4.5mL醋酸一醋酸钠緩冲溶液，投入一张lcmx3cm新华滤纸，一定温度下恒温水浴振荡lh,加入3mLDNS显色剂，煮沸5min,迅速冷却至室温后，定容至25.0mL，静置沉降15min,在530nm处测吸光度。同时作空白实验，即将上述方法中的0.5mL适当稀释的酶液改在加入3mLDNS显色剂之后加入，其他操作同上。加促进剂时酶活的测定方法是将緩冲溶液体积由4.5mL减为4.0mL，并加入0.5mL促进剂溶液。加促进剂时的空白实验是在上述空白实验基础上以0.5mL蒸代替促进剂溶液。1.4.3酶活计算以lmL酶液lhr产生lmg葡萄糖为1个酶活力单位计算相对酶活酶活(mg'hr"'m1/1)=BxA/(txW)A--由标准曲线查出的还原糖量(mg);B——酶的稀释倍数；t——酶解时间(hr);W---反应体系中稀释酶液的体积(mL)。1.5葡萄糖标准曲线的绘制分别取浓度为1.0000g/L葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml，加3mlDNS,煮沸5min,冷却后，用蒸馏水定容至25ml，以空白为参比调零，用分光光度计在530nm波长下测吸光度。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标作图，得葡萄糖标准曲线。表l葡萄糖标准曲线数据表组别12345含糖量(mg)0.20.40.60.81.0吸光度A0.02150.2310.4220.64850.857由葡萄糖曲线数据表计算得:回归方程为Y-1.044X-0.187;回归系数R==0.9997.2.试验方法及结果2.1对纤维素酶促进剂单组分的研究主要研究内容在纤维素酶1的最适反应条件(温度T二50。C,pH二5.5)下,采用滤纸糖化力法分别测定由生化黄腐酸溶液以及四种金属离子Co"、AI3+、Fe3+、Zn"对该纤维素酶活力的影响。按1.3.3方法配制酶液，并稀释25倍。2丄1生化黄腐酸溶液的研究在T^50。C，PH^5.5的条件下，按1.4方法分别考察终浓度为lxl(T3、lxl(T4、lx(T5、lxl(T6、lxl0—7、lxlO—8(g/L)的复方促进剂1号对纤维素酶1的促进作用，结果见表2。表2生化黄腐酸溶液对酶活影响数据表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可见，浓度在lxlO"到lxlO-、范围内生化黄腐酸溶液对纤维素酶有不同程度的促进作用；而在浓度为1><10-7时促进效果最佳,酶活提高率为20.8%。2丄2促进离子1号的研究在T:50。C,pH-5.5的条件下,按1.4方法分别考察终浓度为lxl(T3、lxl(T4、lxl(T5、lxl(T6、lxlO、单位:mol/L)的促进离子1号对纤维素酶活的影响.结果见表3。表3促进离子1号促进效果数据表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表3可见:浓度在lxlO—s到lxlO-s范围内促进离子1号对纤维素酶均有不同程度的促进作用；而在浓度为lxl(^时促进效果最佳,酶活提高率为28.9%。2丄3促进离子2号的研究在T二50。C,pH二5.5的条件下,按1.4方法分别考察终浓度为lxl(T3、lxl(T4、lxl(T5、lxl(T6、lxlO^(单位:mol/L)的促进离子2号对纤维素酶活的影响，结果见表4。表4促进离子2号促进效果数据表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表4可见促进离子2号浓度在lxl0"到1><10-7范围内对纤维素酶均有不同程度的促进作用，其中浓度为lxl(T"时促进效果最佳,酶活提高率为15.3°/0。2丄4促进离子3号的研究在T二50。C,pHH5.5的条件下,按1.4方法分别考察终浓度为lxl(T3、1><10—4、1x10—5、lxl(T6、lxlO卩(单位:mol/L)的促进离子3号对纤维素酶的促进作用。结果见表5。表5促进离子3号促进效果数据表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表5可见:浓度在lxl(^到lxl(T7范围内促进离子3号对纤维素酶均有一定促进作用，但促进作用较小，其中浓度为lxlO"时，酶活提高率为4.10%。2丄5促进离子4号的研究在T-50。C,pH-5.5的条件下,按1.4方法分别考察终浓度为lxl(T3、lxl(T4、lxl(T5、lxl(T6、lxlO、单位:mol/L)的促进离子4号对纤维素酶的促进作用，结果见表6。表6促进离子4号促进效果数据表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表6可见促进离子4号浓度在1x10"到1><10-5范围内对纤维素酶均有不同程度的促进作用，其中浓度为lxl(^时的酶活提高率最大，为22.4%。各组分对纤维素酶酶活的促进效果的对比见表7:表7纤维素酶促进剂单组分促进效果的对比<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>空白管酶活2.652.622.662.632.65样品管酶活3.203.383.072.743.25酶活提高率20.828.915.34.1022.4促进剂单组分对纤维素酶酶活促进效果由大至小分别为:促进离子1号、促进离子4号、生化黄腐酸溶液、促进离子2号、促剂离子3号。2.2纤维素酶促进剂组方的研究选定生化黄腐酸溶液、促剂离子1号、促进离子2号、促进离子4号共四种单组分，应用正交试验设计进行组方的研究。各促进单方选定浓度水平见表8。表8四种促进因子正交试验时的三个浓度水平水平l水平2水平3生化黄腐酸溶液(g/L)1X10—51X1(T61X10—7促进离子l号(mol/L)1X10—31X10—41X10—5促剂离子2号(mol/L)1X10-31X10-41X10—5促进离子4号(mol/L)1X10—11X10—21X10—3在T=50°C,pH=5.5的条件下,按1.4方法分别测定促进剂为以下9种组合时g反应体系的酶活，结果见表9。表9促进剂组方正交表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实验结论对各因素分别计算Ki和ki,分析得出各因素最佳水平分别为生化黄腐酸溶液lxl(^g/L,促进离子1号lxl(rVol/L,促进离子2号lxlO-Smol/L,促进离子3号lxl(T2mol/L。按该水平组合组成的纤维素^进组方，通过对酶活的测定，可〗吏酶活提高率达72.0%。最终确定，本发明纤维素酶酶活促进剂的组方由以下4种组分组成生化黄腐酸溶液、促剂离子1号、促进离子2号和促进离子3号；其最佳的组成浓度为生化黄腐酸溶液lxl(VVL,促进离子1号lxl(TVol/L,促进离子2号lxl(^mol/L，促进离子3号lxl0-2mol/L。2.3纤维素酶酶活促进剂对纤维素酶1的最适条件的影响2.3.1纤维素酶酶活促进剂对酶促反应温度的影响在pH二5.5条件下,分别在40。C、45°C、50°C、55°C、60。C五个温度下按2.4.2.2法测定酶活.温度对酶活的影响。结果见表ll。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表11及图1可看出纤维素酶酶活促进剂并未改变纤维素酶1号的最适温度,且在50。C时有较好的促进效果；温度曲线较为平緩.即纤维素酶酶活促进剂并未使酶促反应对反应温度更为敏感,有利于工业生产中应用；温度值不在最佳温度(5(TC)时，纤维素酶酶活促进剂对纤维素酶仍有很高的促进作用。2.3.2纤维素酶酶活促进剂对酶促反应pH值的影响在温度T二50。C条件下,纤维素酶配制液稀释15倍，分别在4.5、5.0、5.5、6.0、6.5五个pH值下按2.4.2.2法测定酶活.pH值对酶活的影响数据见表12、图2。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表12及图2,可看出纤维素酶酶活促进剂并未改变纤维素酶1号pH值，且在pH^5.5时有较好的促进效果；纤维素酶酶活促进剂使纤维素酶对pH值的敏感度略有升高，即说明在加入纤维素酶酶活促进剂后使酶促反应对反应pH更为敏感；但不在最佳pH值(5.5)时，纤维素酶酶活促进剂对纤维素酶的酶活仍有很高的促进作用。实验例2本发明纤维素酶酶活促进剂广泛适用性的实验一、实验方法将本发明纤维素酶酶活促进剂作用于另一产地的纤维素酶2号(天津利华酶制剂厂固体酶)上，以滤纸糖化力法测定酶活，以检验促进剂促进效果的广泛性.酶促反应条件取:T-5(TC,pH二4.7(根据包装说明书中温度范围50—55°C,pH值范围5.0—5.5选定)。在T=50°C,pH=4.7的条件下，纤维素酶2配制液稀释17.5倍作为样品，本发明纤维素酶酶活促进剂按2.4.2.1法测定酶活.促进效果见表13。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>二、实验结论本发明纤维素酶酶活促进剂对纤维素酶2也具有较大的促进作用，酶活提高率为60.54%。可以认为本发明纤维素酶酶活促进剂对于一定应用范围的工业用纤维素酶均有较好的促进效果。由实验结果可以认为，本发明纤维素酶酶活促进剂对纤维素酶酶活的促进具有一定的普遍适用性。权利要求1、一种纤维素酶酶活促进剂，包括以下彼此独立的各组分组成生化黄腐酸水溶液，Co2+水溶液、Al3+水溶液和Fe3+水溶液。2、按照权利要求l所述的纤维素酶酶活促进剂，其特征在于，各组分的浓度分别为生化黄腐酸1x10-3-1x10-8g/L,Co2+lxlO"-lxlO懇5mol/L,A13+1x10"-1x10懇7mol/L,Fe3+lxlO"隱lxl(T7mol/L。3、按照权利要求2所述的纤维素酶酶活促进剂，其特征在于，各组分的浓度分别为生化黄腐酸1xl(r5g/L,Co2+1xl(T4mol/L，Al3+1xl(T3mol/L,Fe3+1xl(T2mol/L。4、按照权利要求1-3任何一项所述的纤维素酶酶活促进剂，其特征在于所述生化黄腐酸的主要成t分包括黄腐酸20-80%,氨基酸5-10%,N、P、K及中^t量元素25%、水不溶物<3%、pH值4-5。5、一种制备权利要求1-3任何一项所述的纤维素酶酶活促进剂的方法，包括(1)将生化黄腐酸用蒸馏水溶解，滤纸过滤，收集滤液，得到生化黄腐酸水溶液；(2)将Co2+、AlS+和Fe^分别溶于水中，分别得到Co"水溶液、A产水溶液和Fe^水溶液；(3)将步骤(1)和步骤(2)所得到的水溶液分别包装，即得。6、权利要求1-3任何一项所述的纤维素酶酶活促进剂在提高纤维素酶酶活中的用途。全文摘要本发明公开了一种纤维素酶酶活促进剂及其制备方法，属于酶工程领域。本发明纤维素酶酶活促进剂包括以下彼此独立的各组分组成生化黄腐酸水溶液，Co²⁺水溶液、Al³⁺水溶液和Fe³⁺水溶液。其制备方法包括(1)将生化黄腐酸用蒸馏水溶解，滤纸过滤，收集滤液，得到生化黄腐酸水溶液；(2)将Co²⁺、Al³⁺和Fe³⁺分别溶于水中，分别得到Co²⁺水溶液、Al³⁺水溶液和Fe³⁺水溶液；(3)将步骤(1)和步骤(2)所得到的水溶液分别包装，即得。本发明纤维素酶酶活促进剂可提高纤维素酶活力达70％以上，对纤维素酶酶活的促进具有普遍适用性，可应用在纺织、环保、造纸等纤维素酶应用领域。文档编号C12N9/96GK101613689SQ200910088320公开日2009年12月30日申请日期2009年7月3日优先权日2009年7月3日发明者厉重先,李鸿玉申请人:北京联合大学