专利名称：一种高活力纤维素酶和饲料蛋白的联产发酵方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种利用农业废弃物(玉米芯、水稻秸秆) 发酵联产高活性纤维素酶和饲料蛋白的方法。
背景技术：
我国是农业大国，农业纤维素废弃物的来源广泛，主要有玉米秸秆、稻草、麦秆、玉 米芯等，其中绝大部分被直接燃烧，不仅浪费资源，而且造成环境污染。利用生物技术开发
农业纤维素废弃物资源，生产高附加值产品，不但具有重要的经济意义，同时具有环境效益
O利用纤维素酶将农业纤维素废弃物转变成生产和生活中所需的物质是非常有效 的手段。纤维素酶是一类复杂的酶系，它们协同作用，催化纤维素转化为葡萄糖。根据纤维 素酶的底物、作用位点和释放的产物，将纤维素酶分为三类，内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶 和葡萄糖苷酶[2]。纤维素酶在工农业许多领域有着广泛的应用。在食品工业中，纤维 素酶可应用在果蔬菜饮品的生产，啤酒麦芽糖浓度的提高，饲料的营养价值的提高中；在纸 浆和造纸工业，利用纤维素酶进行粗燥纸浆的生物修饰，可以增加纸的韧性和白度；在洗涤 工业，纤维素酶也被广泛用作洗涤添加剂，增强洗涤效果；在生物能源开发中，纤维素酶起 了关键的作用，利用高活性的纤维素酶将纤维素水解生成可发酵糖，再进一步转化为乙醇。目前，国内关于纤维素酶发酵生产已经进行有大量的研究和应用，但也存在一些瓶颈问 题(1)国内纤维素酶的生产主要采用固体发酵法。该法虽然具有投入低、工艺简单的 优点，但是也存在自动化程度低、劳动强度大、产品质量不稳定等局限性Μ。因此，随着液体 发酵工艺的不断进步，采用液体发酵法生产纤维素酶是必然的趋势。(2)利用现有的技术生产出的纤维素酶活力还有待提高，酶系组成还有待完善。一 般生产用的菌株是木霉属真菌，这类真菌生产的纤维素酶系组成不完全，虽然具有很高的 内切葡聚糖酶活性，但是往往葡萄糖苷酶活力偏低，这样的特点会使其应用受到一定 的限制[5]。(3)在纤维素酶的生产发酵及酶解体系中，往往会有大量葡萄糖的积累。这些积累 的葡萄糖会对纤维素酶的发酵和酶解过程产生分解代谢产物的阻遏和反馈抑制，从而影响 纤维素酶的产量和酶活。如何及时消除大量葡萄糖的积累也是酶生产中面临的瓶颈[6]。饲料蛋白即单细胞蛋白，又称微生物蛋白或者菌体蛋白，是指酵母菌、真菌、霉菌、 及非病性细菌等单细胞生物体内所含的蛋白质[7]。一般具有蛋白含量较高，各类氨基酸搭 配合理、种类齐全，维生素和微量元素丰富，不含胆固醇等优点，而这些优势都是一般农作 物饲料所不能比拟的。随着养殖业的快速发展与饲料资源不足的矛盾日趋严重，单细胞蛋 白饲料添加剂的需求量正日益增大[8]。生产饲料蛋白可利用多种工业废液、农副产品加工 下脚料以及植物纤维素。马旭光等人利用玉米秸秆为基料生产酵母饲料，并筛选得到了一 株能在玉米秸秆水解液中生长且高产单细胞蛋白的酿酒酵母菌株[9]。庄桂等人研究了以醋渣为主要原料，经酵母固态发酵生产蛋白饲料，提高了醋渣蛋白含量_。利用各类植物秸 秆、木屑等废弃物的纤维素资源主要是生产霉菌菌体蛋白。一般是利用曲霉、木霉、青霉、根 霉、毛霉等发酵或者与酵母菌进行混菌发酵。李日强等人利用黑曲霉进行固态发酵玉米秸 秆生产饲料蛋白，其SCP转化率达到23% [11]。吴萍等人以甘蔗渣为唯一碳源，对酿造酵母、 产黄青霉进行混菌组合的培养生产饲料蛋白，其粗蛋白含量可达22. 4 % [12]。杨国农等人以 甜菜渣为原料，对固态发酵制备菌体蛋白饲料进行了研究。将纤维素酶水解法替代常规的 黑曲霉发酵法进行原料的预处理，其粗白质质量分数达到21% [13]。虽然我国在饲料蛋白的 开发和生产中进行大量的工作。但是在实际生产应用过程中，也存在一些问题，如单独发酵 法存在种子培养基消耗多、接种量大、发酵时间较长、投资与生产成本较高等不足；混菌发 酵工艺中，由于纤维素酶酶系不完整，产糖量相对较低，抑制了酵母菌的生长，从而影响饲 料蛋白的品质；国内采用的固态发酵法自动化程度低、劳动强度大、产品质量不稳定、饲料 蛋白中粗蛋白的含量不是很高。这些限制性因素制约着我国饲料蛋白工业的发展，传统的 饲料蛋白的发酵工艺相比，本发明的优点如下(1)联产所得的纤维素酶液具备较高酶活力，其内切葡聚糖酶活力可达265. 7U/ mL ；而且拥有较完整的酶系组成，其β-葡萄糖苷酶活力可达到191.4U/mL，能有效提高该 纤维素酶液的水解糖化能力；(2)所得饲料蛋白不仅蛋白含量高，其粗蛋白含量可达39%以上；并且经国家饲 料质量监督检验中心检测结果表明，该饲料蛋白无毒无害，营养丰富。(3)本方法采用分期联产发酵技术，在产酶发酵的中后期接入经驯化的产脘假丝 酵母LW05不仅能利用发酵及酶解过程中产生的葡萄糖进行生长，积累大量的菌体蛋白；同 时也消除了发酵液中葡萄糖对纤维素酶生产及酶解过程的反馈抑制效应，提高了纤维素酶 的产量及酶活力。参考文献[1]李日强，席玉英.纤维素类废弃物的综合利用[J].中国环境科学.2002， 22(001) 24-27.[2] Lynd L R, Weimer P J, van Zyl W H, et al. Microbial Cellulose Utilization !Fundamentals andBiotechnology[J]. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002, 66(3) :506-577.[ 3 ] Sukumaran R K, Singhania R R, Pandey A. Microbial cellulases-Production, applications andchallenges[J].[4]刘凯，林建强，曲音波.纤维素酶生产技术[J].生物产业技术.2008,4.[5]Wen Z， Liao W， Chen S.Production of cellulase/[beta]-glucosidase by the mixed fungi cultureTrichoderma reesei and Aspergillus phoenicis on dairy manure[J]. Process Biochemistry. 2005,40(9) :3087_3094·[6]Kang S W，Ko E H，Lee J S，et al. Over-production of β -glucosidase by Aspergillus nigermutant from lignocellulosic biomass [J]. Biotechnology Letters. 1999,21(8) :647-650.[7] Chae S R，Hwang E J，Shin H S. Single cell protein production of Euglena gracilis and carbondi ox i de fixation in an innovative
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发明内容
本发明的目的在于提供一种生产工艺简单、成本低廉、经济环保的利用农业纤 维素废弃物发酵联产高活性纤维素酶和饲料蛋白的方法。为了达到上述目的，本发明采 用的发酵菌株为选育的黑曲霉FL26 (Aspergillus niger FL26)和驯化的产脘假丝酵母 LW05 (Candida utilisLW05)，以农业纤维素废弃物为原料，发酵联产高活力纤维素酶和优 质饲料蛋白，包括以下步骤1.菌种活化将2株优选得到的菌株分别接种于PDA固体活化培养基，30°C恒温 培养3天。将经PDA固体培养基活化后的黑曲霉FL26和产脘假丝酵母LW05分别接入液体 活化培养基I和液体活化培养基II中，30°C、180r/min通气培养48h。PDA固体活化培养基马铃薯汁(将200g马铃薯去皮切块，加适量蒸馏水浸煮，用 纱布过滤)，葡萄糖20g,琼脂20g,加水至IOOOmL,自然pH。种子活化培养基I 葡萄糖10g，蛋白胨lg，无机盐营养液1L。种子活化培养基II 蔗糖30g，NaNO3 2g，无机盐营养液1L。无机盐营养液(NH4)2SO46g，KH2PO4 lg, MgSO4 · 7H20 5g，CaCl2O. lg, NaCl 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 05g, MnSO4 · H2O 0. 016g, ZnSO4 · 7H20 0. 014g, CoCl2 0. 02g，蒸溜水 1L。2.发酵工艺先将经种子活化培养基I活化的黑曲霉FL26液体种子培养液，按照 液体发酵培养基体积10%的接种量接入液体发酵培养基，30°c、180r/min通气培养4天。 再以原液体发酵培养基体积10%的接种量接入产脘假丝酵母LW05液体种子培养液，30°C、 180rpm继续通气培养2天。液体发酵培养基玉米芯(粉碎后60目过筛)20g，水稻秸秆(粉碎后60目过 筛)10g，酵母粉20g，无机盐营养液1L，自然pH。3.产物分离将所得到的发酵终产物进行超滤处理，截留分子量为20kD，超滤时 间24h，得到的滤液即为纤维素酶液，固体残渣用干燥机或压滤机脱水干燥，粉碎后制得饲 料蛋白。4.纤维素酶制剂的生产
(1)取经超滤获得的酶液，先加50%饱和度的硫酸铵，4°C静置12h，IlOOOrpm离心 30min,弃去沉淀，然后补加硫酸铵至饱和度80 %，4°C静置12h，1 IOOOrpm离心60min，收集 沉淀。用PH4. 8的醋酸缓冲液重新溶解该沉淀，得到浓缩酶液。(2)采用S^hadex G200凝胶层析除去酶液中的盐类并对酶液进行分离纯化，洗 脱速度为0. 5mL/min，可分别得到高活力的内切葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶。
图1.混菌6天发酵联产纤维素酶及饲料蛋白曲线图2.高活力纤维素酶和饲料蛋白的联产发酵工艺流程图
具体实施例方式以下将结合附图和具体实例对本发明作进一步说明。实施例1 发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白1.发酵原料的预处理及发酵培养基的制备用粉碎机将玉米芯、水稻秸秆粉碎，用60目过筛，烘干备用。配制液体发酵培养基，其成分为玉米芯(粉碎后60目过筛)20g，水稻秸秆(粉 碎后60目过筛)10g，酵母粉20g，无机盐营养液1L。121°C，0. IMpa灭菌30min。2.菌种及活化(1)菌种产高活力纤维素酶菌株Aspergillus niger FL26高产单细胞蛋白菌株Candida, utilis LW05(2)菌种活化将2株优选得到的发酵菌株分别接种于PDA固体活化培养基，30°C恒温培养3天。 将经固体平板活化后的黑曲霉FL26和产脘假丝酵母LW05菌株分别接入液体活化培养基I 和液体活化培养基II中，30°C、180rpm通气培养48h。PDA固体活化培养基马铃薯汁(将200g马铃薯去皮切块，加适量蒸馏水浸煮，用 纱布过滤)，葡萄糖20g,琼脂20g,加水至IOOOmL,自然pH。种子活化培养基I 葡萄糖10g，蛋白胨lg，无机盐营养液1L。种子活化培养基II 蔗糖30g，NaNO3 2g，无机盐营养液1L。无机盐营养液(NH4)2SO46g，KH2PO4 lg, MgSO4 · 7H20 5g，CaCl2 0. lg, NaCl 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 05g, MnSO4 · H2O 0. 016g, ZnSO4 · 7H20 0. 014g, CoCl2 0. 02g，蒸溜水 1L。3.发酵工艺先将经活化的黑曲霉FL26液体种子，按照液体发酵培养基体积10%的接种量接 入液体发酵培养基，30°C、ISOrpm通气培养4天。再以原液体发酵培养基体积10%的接种 量接入产脘假丝酵母LW05液体种子，30°C、ISOrpm再通气培养2天。液体发酵培养基玉米芯(粉碎后60目过筛)20g，水稻秸秆(粉碎后60目过 筛)10g，酵母粉20g，无机盐营养液1L。发酵过程中内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和发酵残渣粗蛋白的含量变化，如图1 所示。发酵至第6天时，所得内切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶的酶活力及饲料蛋白的粗蛋白 含量均处于较高水平，分别为265. 7U/mL、191. 4U/mL和39. 1 %。混菌发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的工艺流程，如图2所示。实施例2 纤维素酶制剂的生产1.产物分离将按照实施例1所得到的发酵6天终产物进行超滤处理，截留分子 量为20kD，超滤时间24h，得到的滤液即为纤维素酶液。2.浓缩酶液取经超滤获得的酶液，先加50%饱和度的硫酸铵，4°C静置12h， IlOOOrpm离心30min，弃去沉淀，然后补加硫酸铵至饱和度80%，4°C静置12h，IlOOOrpm离 心60min，收集沉淀。用适量pH4. 8的醋酸缓冲液溶解该沉淀，得到浓缩酶液。3.分子筛层析收集所得浓缩酶液，采用Si^phadex G200凝胶柱层析，洗脱速度为 0. 5mL/min。通过分子筛凝胶层析，既可除去酶浓缩液中的盐类(硫酸铵)，同时也可从浓缩 酶液中分离得到高活力内切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。经过酶学性质的研究，其中内切 葡聚糖酶的最适反应温度为60°C，最适反应pH为4. 0 ； β -葡萄糖苷酶的最适反应温度为 600C，最适反应ρΗ为5. 0，分子量约为130kD。实施例3 饲料蛋白的生产将按照实施例1所得到的发酵6天终产物进行超滤处理，所得固体残渣用干燥机 或压滤机脱水干燥，粉碎后制得饲料蛋白。经国家饲料质量监督检验中心(北京)检测结果表明以农业纤维素废弃物为原 料，经过联产发酵得到的饲料蛋白，其粗蛋白、粗脂肪、灰分含量均有提高，而粗纤维则有明 显降低；各类有益氨基酸含量提高、丰富，营养价值增加；各类维生素如A、D、E、B1、B2、叶酸 等均有提高；重金属元素含量符合国家同类饲料基料卫生标准要求；沙门氏菌未检出，霉 菌、细菌总数符合国家规定，黄曲霉素含量远远小于同类饲料基料等国家饲料卫生标准的 要求。产品属无毒级，可作为饲料蛋白广泛应用于养殖领域。
权利要求
一种高活力纤维素酶和饲料蛋白的联产发酵方法，其特征在于将黑曲霉FL26(A.nigerFL26)和产脘假丝酵母LW05(C.utilis LW05)两种发酵菌株分别在发酵的不同时期接种到以农业纤维素废弃物(玉米芯和水稻秸秆)为原料的培养基中，使用液态发酵工艺，同时生产高活力纤维素酶及饲料蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种高活力纤维素酶和饲料蛋白的联产发酵方法，其特征在 于包括以下步骤(1)菌种活化将黑曲霉FL26和产脘假丝酵母LW05分别接种到PDA固体活化培养基 中，30°C恒温培养3d。然后将活化后的黑曲霉FL26和产脘假丝酵母LW05分别接入种子活 化培养基I和种子活化培养基II中，30°C、180rpm通气培养48h。(2)发酵工艺先将经活化的黑曲霉FL26液体种子，按照液体发酵培养基体积10%的 接种量接入液体发酵培养基，30°C、180rpm通气培养4天。再以原液体发酵培养基体积10% 的接种量接入产脘假丝酵母LW05液体种子，300C、ISOrpm再通气培养2天。(3)产物分离与纯化将所得到的发酵终产物进行超滤处理，得到的滤液即为纤维素 酶粗酶液，利用盐析、Sephadex G200凝胶层析进行纯化可分别得到内切葡聚糖酶和β-葡 萄糖苷酶的酶制剂；固体残渣用干燥机或压滤机脱水干燥，粉碎后制得饲料蛋白。
3.根据权利要求2所述的发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法，其特征在于 优选得到的发酵菌株黑曲霉FL26 (A. niger FL26)，具备利用农业纤维素废弃物发酵生产高 活力纤维素酶的能力，所产纤维素酶具备完整的纤维素酶系组成，含有较高的葡萄糖 苷酶活性。
4.根据权利要求2所述的发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法，其特征在于 经优选驯化得到的高产SCP菌株产脘假丝酵母LW05 (C. utilis LW05)，能利用农业纤维素 废弃物分解产生的葡萄糖为碳源，快速生长，并和黑曲霉FL26互相配伍，有效提高纤维素 酶的酶活力和产量。
5.根据权利要求2所述的发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法，其特征在于， 上述步骤2(1)中的种子活化培养基I组分如下葡萄糖10g，蛋白胨lg，无机盐营养液1L。无机盐营养液组成为=(NH4)2SO4 6g，KH2PO4 lg, MgSO4 · 7H20 5g，CaCl2 0. lg, NaCl 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 05g, MnSO4 · H2O 0. 016g, ZnSO4 · 7H20 0. 014g, CoCl2 0. 02g，蒸馏水 1L。
6.根据权利要求2所述的发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法，其特征在于， 上述步骤2(1)中的种子活化培养基II组分如下蔗糖30g，NaNO3 2g，无机盐营养液1L。
7.根据权利要求2所述的发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法，其特征在于， 上述步骤2 (2)中的液体发酵培养基组分如下玉米芯(粉碎后60目过筛)20g，水稻秸秆(粉碎后60目过筛)10g，酵母粉20g，无机 盐营养液1L。
8.根据权利要求2所述的发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法，其特征在于， 上述步骤2 (2)中，黑曲霉FL26单独发酵的时间为4天，与产脘假丝酵母LW05混合发酵的 时间为2天。
9.根据权利要求2所述的发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法，其特征在于， 上述步骤2(3)中盐析过程中所用硫酸铵饱和度区间为50-80%。
10.根据权利要求2所述的发酵联产高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法，其特征在于， 上述步骤2(4)中S印hadex G200凝胶层析过程中所用洗脱速度为0. 5mL/min。
全文摘要
本发明公开了一种通过发酵联产工艺制备高活力纤维素酶和饲料蛋白的方法。其生产工艺如下以农业纤维素废弃物(玉米芯、水稻秸秆)为主要原料，接种选育的黑曲霉FL26(Aspergillus niger FL26)进行高活力纤维素酶液态发酵，在发酵的第4天接入经驯化的产脘假丝酵母LW05(Candida utilis LW05)，继续进行发酵。发酵完成后，经超滤后得到上清和固态残渣两部分。其中的上清液为高活力纤维素酶液，从中可分离纯化出高活力的内切葡聚糖酶(265.7U/mL)和β-葡萄糖苷酶(191.4U/mL)，固态残渣经烘干、破碎即为优质饲料蛋白。饲料蛋白中粗蛋白含量可达39％以上，经国家饲料质量监督检验中心(北京)检测结果表明，该饲料蛋白无毒无害，营养丰富。
文档编号C12P39/00GK101935641SQ20101013475
公开日2011年1月5日 申请日期2010年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者傅霖, 朱立伟, 辛明秀 申请人:辛明秀;傅霖;朱立伟