专利名称：一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法
技术领域：
本发明涉及纤维素酶活力测定方法，具体说是一种羧甲基纤维素酶活力 (CMCNa-DNS)的测定方法。
背景技术：
纤维素酶(Cellulase)是一种多组分的复合酶，不同来源的纤维素酶其组成及各组分比例有较大差异。一般来讲，纤维素酶包括外切β-1，4-葡聚糖酶(Exop-1， 4-glucanase,E C3. 2·1. 91)、内切 β-1，4-葡聚糖酶(Endop-1,4-glucanase,E C3. 2.1. 4) 和纤维二糖酶(Cellobiase，E C3. 2.1. 21)。不同来源的纤维素酶制剂产品中三种酶组分含量的比例不同，因此其最终的表观酶活力会有差异。同时纤维素酶作用的底物也比较复杂，致使纤维素酶活力的测定方法很多，且方法复杂而不统一。常用的方法有羧甲基纤维素糖化力法、羧甲基纤维素液化力法、滤纸糖化力法、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等。上述测定方法中，羧甲基纤维素糖化力主要代表外切β_1，4葡聚糖苷酶和内切酶的活力总和， 在研究和实际生产中应用比较普遍。
国内外采用羧甲基纤维素糖化法测定纤维素酶活力的方法很多。目前，国际上有较公认的IPUAC推荐的纤维素酶测定方法(Τ. K. GHOSE, 1987)，该方法分别对来自三个厂家 (Primfast CL购自杰能科公司，Cellusoft L购自诺维信公司,Α5为本公司自主研发产品) 纤维素酶进行多次检测，其变异系数达2%以上。造成较大误差的原因可能是加入的羧甲基纤维素钠浓度高和粘度大，容易在操作过程中带来较大误差，且该方法反应时间为30分钟，利用比色管显色后需稀释用分光光度计检测吸光度值，整个操作繁琐且耗时；另外，该方法DNS (3，5- 二硝基 水杨酸)试剂配制未经定容，从而造成批次间测定结果存在较大差巳发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的测定过程复杂，测定不准确的问题，提供一种新的羧甲基纤维素酶活力的测定方法，采用本发明的方法，测定过程简便快速，测定现象清晰明了，测定结果准确可靠。
本发明是采用如下技术方案实现的
一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，包括如下步骤
(I)猴头菌培养物溶液的制备猴头菌培养物经粉碎，过筛，以适量水溶解，振摇 2^4小时，滤过，定容。
(2)吸光度测定精密量取1%羧甲基纤维素钠溶液1. 5ml置具塞刻度试管中，精密加猴头菌培养物溶液O. 5ml，混匀，置45飞5°C水浴中保温25 35分钟，取出，立即精密加入DNS试剂1. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温5 15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置广2小时，以空白管进行调零，在540nm波长处测定吸光度。空白管加1% 羧甲基纤维素钠溶液1. 5ml，置45飞5°C水浴中保温25 35分钟，取出，精密加猴头菌培养物溶液O. 5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温5 15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置广2小时。
(3)计算羧甲基纤维素酶活力从葡萄糖标准曲线上读出猴头菌培养物溶液中还原糖的重量(mg)，按照下式计算羧甲基纤维素酶活力
U=AX 1/0. 5XnX2
式中U——每Ig含酸性羧甲基纤维素酶活力单位，U/g ;
A——吸光度在标准曲线上查得的还原糖重量，mg ；
η——样品稀释倍数；
2——时间换算系数。
Ig固体酶在50±1°C、pH4. 8条件下，I小时水解1%羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于I mg葡萄糖的还原糖量为一个酸性羧甲基纤维素酶活力单位，以U/g表示。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定方法，其中步骤(3)所述的葡萄糖标准曲线测绘方法为:分别精密量取O. 2 mg/ml、0· 4 mg/ml、0. 6 mg/ml、0. 8 mg/ml、1. Omg/ml 的葡萄糖对照品溶液1. 5ml，置具塞刻度试管中，各精密加pH4. 8柠檬酸盐缓冲液O. 5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温5 15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟， 再加水至刻度，摇匀，静置广2小时，以相应的试剂为空白，在540nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述具塞刻度试管容积为25ml。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述猴头菌培养物溶液为8 10 mg/ml, 且临用新制。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述羧甲基纤维素钠溶液的配置方法是精密称取1. Og羧甲基纤维素钠，置具塞锥形瓶中，精密加入pH4. 8柠檬酸盐缓冲液80ml，称定重量，85±5°C边加热边磁力搅拌至完全溶解，放冷，再称定重量，用pH4. 8柠檬酸盐缓冲液补足减失的重量，摇匀，以3mol/l盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH至4. 8，转移至IOOml 量瓶中，加PH4. 8柠檬酸盐缓冲液至刻度，摇匀，即得1%羧甲基纤维素钠溶液。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述DNS试剂的配置方法是取结晶酚 6. 9g，加10%氢氧化钠溶液15ml溶解后，加水稀释至70ml，摇匀，再加入6. 9g亚硫酸氢钠， 即得DNS甲液。取酒石酸钾钠255g，加10%氢氧化钠溶液300ml溶解后，再加入1%3，5- 二硝基水杨酸880ml，摇匀，即得DNS乙液。取上述甲液与乙液混合，摇匀，置玻璃塞的棕色玻瓶中，4°C放置7天后使用。
本发明的测定方法是经过考察显色剂用量、显色时间、静置时间、羧甲基纤维素钠底物浓度、酶促反应温度、酶促反应时间、酶液稀释度等猴头菌培养物活性成分酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响因素，以及该测定方法的精密度与适应性，最终确立的酸性羧甲基纤维素酶活力的测定方法。采用本发明进行酸性羧甲基纤维素酶活力的测定，测定方法简便快速，测定现象清晰明了，测定结果准确可靠。
显色剂DNS试剂用量对吸光度测定的影响精密量取O. 5mg/ml葡萄糖标准溶液1. 5ml置25 ml具塞刻度试管中，精密加入pH4. 8柠檬酸盐缓冲液O. 5ml及不同体积的DNS 试剂，摇匀，置沸水浴中保温30分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀， 静置1. 5小时，在540nm波长处测定吸光度，结果如表I、
图1所示。
表I显色剂用量对吸光度测定的影响
体积(.ml)0.50.71.01.21.51.72.0540nm吸光度0.1470.1940.2780.32603670.3760.381
结果表明，当显色剂DNS试剂用量小于1. 5ml时，吸光度随显色剂用量的增加而增大，当显色剂用量大于1. 5ml时，吸光度则基本保持不变。因此，显色剂DNS试剂的最适用量为1. 5ml。
显色时间对吸光度测定的影响精密量取O. 5mg/ml葡萄糖标准溶液1. 5ml置25 ml具塞刻度试管中，精密加入pH4. 8柠檬酸盐缓冲液O. 5ml及DNS试剂1. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温不同时间，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1. 5小时， 在540nm波长处测定吸光度，结果如表2、图2所示。
表2显色时间对吸光度测定的影响
时间Cmin)I3571012151720540ηηι吸光度0.1730.2870.3560.3680.3780.3840.3910.3920.392
结果表明，随沸水浴显色时间的延长，吸光度变大，但在15分钟之后，吸光度较稳定。因此，沸水浴显色时间确定为15分钟。
静置时间对吸光度测定的影响精密量取葡萄糖标准溶液1. 5ml置25 ml具塞刻度试管中，精密加入PH4 . 8柠檬酸盐缓冲液O. 5ml及DNS试剂1. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温 15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，立即在540nm波长处进行时间程序扫描3小时，结果如图3所示。
结果表明，当静置时间小于1. 5小时时，随静置时间的增加，吸光度逐渐增加；当静置时间大于2. O小时时，随静置时间的增加，吸光度逐渐减小；静置时间在1. 5^2. O小时时，吸光度基本保持不变。因此，静置1. 5小时后在540nm波长处测定吸光度。
羧甲基纤维素钠底物浓度对酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响精密量取以 pH4. 8柠檬酸盐缓冲液配置的浓度依次为O. 2%,O. 4%,O. 6%,O. 8%、1. 0%、L 2%、L 4%的羧甲基纤维素钠底物溶液各1. 5ml,置25ml具塞刻度试管中，样品管精密加入纤维素酶液O.5ml，空白管精密加入水O. 5ml，混匀，同时置50°C水浴中保温30分钟，取出，均立即精密加入DNS试剂1. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1. 5小时，在540nm波长处测定吸光度，结果如表3、图4所示。
表3羧甲基纤维素钠底物浓度对酶活力测定的影响
底物浓度(％)0.20.40.60.81.01.21.4540nm吸光度O L0.0890.1370.1670.1890.1950.198
结果表明，随羧甲基纤维素钠底物浓度的增大，酶活力测定结果也逐渐增加，当其浓度达到1.0%时，酸性羧甲基纤维素酶活力基本趋于平缓。因此，选择1. 0%羧甲基纤维素钠底物浓度进行酶活力的测定。
酶促反应温度对酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响精密量取1. 0%羧甲基纤维素钠溶液1. 5ml置25ml具塞刻度试管中，样品管精密加入纤维素酶液O. 5ml,空白管精密加入水O. 5ml，混匀，于不同温度水浴中保温30分钟，取出，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀， 静置1. 5小时，在540nm波长处测定吸光度，结果如表4、图5所示。
表4酶促反应温度对酶活力测定的影响
权利要求
1.一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，包括如下步骤 (1)猴头菌培养物溶液的制备猴头菌培养物经粉碎，过筛，以适量水溶解，振摇2 4小时，滤过，定容。
(2)吸光度测定精密量取1%羧甲基纤维素钠溶液I.5ml置具塞刻度试管中，精密加猴头菌培养物溶液O. 5ml，混匀，置45飞5°C水浴中保温25 35分钟，取出，立即精密加入DNS试剂I. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温5 15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置广2小时，以空白管进行调零，在540nm波长处测定吸光度。空白管加1%羧甲基纤维素钠溶液I. 5ml，置45飞5°C水浴中保温25 35分钟，取出，精密加猴头菌培养物溶液O. 5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂I. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温5 15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置广2小时。
(3)计算羧甲基纤维素酶活力从葡萄糖标准曲线上读出猴头菌培养物溶液中还原糖的重量(mg)，按照下式计算羧甲基纤维素酶活力 U=AX 1/0. 5XnX2 式中U——每Ig含酸性羧甲基纤维素酶活力单位，U/g ； A——吸光度在标准曲线上查得的还原糖重量，mg ； η——样品稀释倍数； 2—时间换算系数。
Ig固体酶在50±1°C、ρΗ4. 8条件下，I小时水解1%羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于I mg葡萄糖的还原糖量为一个酸性羧甲基纤维素酶活力单位，以U/g表示。
2.如权利要求I所述的羧甲基纤维素酶活力的测定方法，其特征在于步骤(3)所述的葡萄糖标准曲线测绘方法为分别精密量取O. 2 mg/ml>O. 4 mg/ml>O. 6 mg/ml>O. 8 mg/ml、I.Omg/ml的葡萄糖对照品溶液I. 5ml，置具塞刻度试管中，各精密加pH4. 8柠檬酸盐缓冲液O.5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂I. 5ml，摇匀，置沸水浴中保温5 15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置广2小时，以相应的试剂为空白，在540nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。
3.如权利要求I所述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其特征在于上述具塞刻度试管容积为25ml。
4.如权利要求I所述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其特征在于上述猴头菌培养物溶液为8 10 mg/ml,且临用新制。
5.如权利要求I所述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其特征在于上述羧甲基纤维素钠溶液的配置方法是精密称取I. Og羧甲基纤维素钠，置具塞锥形瓶中，精密加入PH4. 8柠檬酸盐缓冲液80ml，称定重量，85±5°C边加热边磁力搅拌至完全溶解，放冷，再称定重量，用PH4. 8柠檬酸盐缓冲液补足减失的重量，摇匀，以3mol/l盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH至4. 8，转移至IOOml量瓶中，加pH4. 8柠檬酸盐缓冲液至刻度，摇匀，即得1%羧甲基纤维素钠溶液。
6.如权利要求I所述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其特征在于，上述DNS试剂的配置方法是取结晶酚6. 9g，加10%氢氧化钠溶液15ml溶解后，加水稀释至70ml，摇匀，再加入.6.9g亚硫酸氢钠，即得DNS甲液。取酒石酸钾钠255g，加10%氢氧化钠溶液300ml溶解后，再加入1%3，5-二硝基水杨酸880ml，摇匀，即得DNS乙液。取上述甲液与乙液混合，摇匀，置玻璃塞的棕色玻瓶中， 4°C放置7天后使用。
全文摘要
本发明涉及一种羧甲基纤维素酶活力测定方法。经过考察显色剂用量、显色时间、静置时间、羧甲基纤维素钠底物浓度、酶促反应温度、酶促反应时间、酶液稀释度等猴头菌培养物活性成分酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响因素，以及该测定方法的精密度与适应性，最终确立了酸性羧甲基纤维素酶活力的测定方法。本发明具有测定方法简便快速，测定现象清晰明了，测定结果准确可靠。
文档编号G01N21/31GK102980856SQ20121015457
公开日2013年3月20日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者何述金, 常耀台, 贾林, 周代俊, 周准 申请人:何述金