专利名称：一种广泛耐药摩氏摩根菌及其在新型抗菌药物筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种广泛耐药(extensivedrug resistant, EDR)摩氏摩根菌，以及该摩氏摩根菌在新型抗菌药物筛选中的应用。
背景技术：
目前，由于抗菌药物的广泛使用，细菌对抗菌药物的耐药性日益严重，因此，迫切需要发现具有新结构和新作用机制的抗细菌化合物，以有效地治疗耐药菌引起的一系列疾病(Coates AR, Hu Y. Novelapproaches to developing new antibiotics for bacterialinfections. Br J Pharmacol, 2007,152 :1147-1154. ；Davies J. Where have all the antibiotics gone ？ CanJ Infect Dis MedMicrobiol，2006，17 :287-290.)。通过以广泛耐药菌(对多种抗菌药物耐药的细菌)为模式生物构建细胞水平的药物筛选模型进行新药的筛选，既可以排除已知作用机制的化合物干扰，提高新药发现的效率，又可以避免单靶点的分子模型带来的漏筛，有可能由此发现尚未发现的全新靶点的抗菌药物。但是目前还没有合适的广泛耐药菌株可以用于药物筛选，因此，寻找广泛耐药的新型耐药菌株是新药筛选领域亟需解决的技术问题。摩氏摩根菌属于革兰氏阴性杆菌，广泛分布于多种自然环境以及人和动物的肠道内。临床分离的摩氏摩根菌常具有对内酰胺类抗菌药物的天然的耐药性，例如对青霉素、氨苄西林、氨苄西林和苏巴坦组合剂、苯唑西林、第一和第二代头孢霉素、红霉素、多黏菌素Ε、多黏菌素B等常见抗菌药物天然耐药。而对哌拉西林、替卡西林、美洛西林、第三和第四代头孢霉素、碳青霉烯类、氨曲南、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、氯霉素类抗菌药物敏感 (James R Miller :MorganellaInfections [Online]. Retrieved from http://emedicine. medscape. com/article/222443-treatment)0本发明人进行了深入的研究，分别在培养基中加入青霉素、头孢吡肟、链霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、交沙霉素、杆菌肽、粘菌素、利福平、磺胺甲恶唑等，以此作为耐药菌的耐药筛选指标，终于从养殖池塘水体和病死的鲍鱼体内菌群中筛选出了能够耐受上述药物的新型摩氏摩根菌。获得的广泛耐药摩氏摩根菌除具有上述的天然耐药性之外，对野生型应该敏感的氨基糖苷类、喹诺酮类和氯霉素类等抗菌药物耐药性也明显提高。从而为构建细胞水平的新型抗菌药物筛选模型提供了一个理想的广泛耐药菌，进而提供了新型的抗菌药物筛选模型。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种摩氏摩根菌，其保藏编号为CGMCCNo. 3655，保藏日期 2010年3月10日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明的另一方面涉及所述的摩氏摩根菌在新型抗菌药物筛选中的应用。本发明的又一方面涉及一种筛选新型抗菌药物的方法，其特征在于，所述方法使用本发明的摩氏摩根菌。利用上述广泛耐药菌的摩式摩根菌作为模式生物，联合使用敏感型的摩式摩根菌，通过比较不同样品对二者抑菌活性的差异，发现具有新结构和新作用机制的抗广泛耐药菌的药物。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括初筛步骤和复筛步骤。在本发明的一个实施方案中，所述初筛步骤为纸片法或96孔板法。在本发明的一个实施方案中，所述新型抗菌药物来自微生物发酵液、植物提取液、 或化合物。本发明人以本发明的摩氏摩根菌作为筛选模型，对已知结构和作用机制的化合物进行筛选，评价模型对传统作用机制抗菌药物的抗干扰能力。同时利用耐药菌筛选化合物库，计算初筛模型的阳性率并与模型评价标准进行比较判断模型选择性及可靠性。其中，所述模型评价标准如下初筛标准1)多数与表1中MICk > 100 μ g/ml抗菌药物为同类的样品不能被筛选到；2)与表1中MICk < 100 μ g/ml抗菌药物为同类的样品可以被筛选到；3)作用机制不同于表1中列举抗菌药物的样品可以被筛选到。复筛标准分别测定初筛阳性样品对耐药菌和敏感菌抑菌圈大小和MIC值。1)样品抑菌圈直径差异(敏感菌抑菌圈直径)_ΦΚ(耐药菌抑菌圈直径)彡5mm，且MIC差异(MICK/MICS)彡4倍的抗菌药物，极有可能属于该广泛耐药菌已经产生耐药的一类抗菌药物，因此被定义为复筛阴性；2)抑菌圈直径差异Φ3_ΦΚ < 5mm的，且MIC差异< 4倍的样品，克服了该广泛耐药菌的耐药机制，其作用机制可能不同于表1中列举除利福平(0. 5倍耐药差异)外的抗菌药物，因此被定义为复筛阳性。无论是对发酵液还是化合物的筛选结果都可以看出，该模型与其他的全细胞筛选模型(非选择性的野生菌株或敏感菌株，该敏感菌株为泛指用来筛选抗某一类细菌或广谱抗菌药物的敏感菌株，如筛选抗结核药物用结核标准菌株H37Rv、H37Ra等。)相比，其对传统作用机制的抗菌药物排除能力更强，对化合物和发酵液初筛的阳性率都小于1 %。当用抑菌圈差异比较对其进行复筛时，化合物筛选阳性率降到大约0. 03%。实施例4中筛选得到的阳性化合物2-溴-2-硝基丙二醇作用机制为，与细胞表面的脱氢酶的硫化氢基团交联，使分子中的溴离子电子缺失，细胞内氧化能力减弱，而甲醛释放量增加，从而使细菌死亡。遗憾的是，2-溴-2-硝基丙二醇毒性过高不能成药(小鼠的 LD50 = 194-374mg/kg，大鼠的 LD50 = 267_342mg/kg) (Legin G Ya. 2-Bromo-2-nitro-l, 3-propanediol(Bronopol) and itsderivatives Synthesis, Properties and application. Pharmaceutical Chemistry Journal, 1996,30 :273_284·) 。{Si2___2—石肖基丙二醇的抗菌机制不同于所有表1中列举抗菌药物，该结果亦证明此模型的选择性较好，可以筛选到非传统作用机制的新药。本发明的有益效果本发明的摩氏摩根菌作为一种“天然”的全细胞筛选模型，与以往的全细胞筛选模型相比，具有以下优势
1.由于该菌株具有广谱耐药性，故可以在筛选初期就将多数传统作用机制的抗菌化合物排除掉，省去了通过分离纯化、结构鉴定的方法排除已知作用机制的抗菌化合物所花费的大量时间和经费；2.该模型不局限于一个筛选靶点，不但可以筛选到作用于已知靶点的化合物，还可以筛选到作用于未知靶点的化合物，极大地提高了得到新作用机制化合物的可能性。
图1 各种初筛阳性化合物对耐药菌、敏感菌抑菌圈大小比较。图中数字分别代表1，01A2(化合物编号，氟喹诺酮类)；2，01A3(化合物编号，氟喹诺酮类)；3，01A4(化合物编号，氟喹诺酮类)；4，01A6(化合物编号，氟喹诺酮类)；5，西索霉素(氨基糖苷类)；6，巴龙霉素(氨基糖苷类)；7，头孢曲松(头孢类)；8，阿奇霉素(大环内酯类)；9， 2-溴-2-硝基丙二醇。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。材料和方法菌株本发明的摩氏摩根菌以及其他耐药菌分离自养殖池塘水体和病死的鲍鱼体内；敏感摩氏摩根菌(ATCC25830)购自美国菌种保藏中心。生化试剂和药品MH肉汤培养基、琼脂(均购自北京天坛生物制品公司)；培养基液体培养基MH肉汤培养基25g加IL水，高温灭菌。固体培养基在如上液体培养基的基础上添加15g琼脂粉。抗菌药物青霉素、氨苄西林、替卡西林、舒巴坦、克拉维酸、头孢噻吩、头孢吡肟、氨曲南、美罗培南、链霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、氯霉素、磷霉素、万古霉素、交沙霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素、利福平、杆菌肽、粘菌素(以上抗菌药物均购自中国药品生物制品检定所)。实施例1 广泛耐药菌的筛选从感染致死的鲍鱼尸体及其生存的池水中分离得到97株菌株，分别将这些菌株在含有10yg/ml和100yg/ml抗菌药物的琼脂平板上涂板，共使用了 10种抗菌药物(青霉素、头孢吡肟、链霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、交沙霉素、杆菌肽、粘菌素、利福平、磺胺甲恶唑)。37°C培养M小时，能在所有种类的抗菌药物平板上都存活的菌株为筛选得到的广泛耐药菌。
结果是在10μ g/ml浓度下得到12株可以在所有十种抗菌药物平板上均可以生长的菌株，当抗菌药物浓度为100 μ g/ml时，获得2株可以在所有十种抗菌药物平板上均可以生长的菌株。实施例2:菌种的鉴定16S rDNA序列比对鉴定菌种。以细菌16S rDNA序列为模板，进行PCR。所用引物为通用引物，如下正向(8-27位碱基)，5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(SEQ IDNO 1)；反向(1523-1504位碱基)，5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，(SEQ IDNO 2)。PCR 条件:95V 5min,然后在 95°C lmin, 55°C lmin, 72°C 3min 的条件下进行；35 个循环，最后在72°C lOmin。测序由上海生工完成。利用BLAST软件将测序结果与GeneBank 数据库比对鉴定种属。结果是其中一株菌的PCR试验失败(后经18S rDNA测序鉴定为白色念珠菌)； 另一株耐药菌16S rDNA序列与摩氏摩根菌16S rDNA序列在NCBI网站上利用BLAST比对，序列的一致性为99.4%，表明其为摩氏摩根菌的突变株。将该菌株与敏感摩氏摩根菌 (ATCC25830)菌株进行16S rDNA序列比对，一致率为99. 3%，因此可判断两株菌归为同种 (Clarridge JE 3rd. Impact of 16S rRNA gene sequence analysisfor identification of bacteria on clinical microbiology andinfectious diseases. Clin Microbiol Rev, 2004，17 :840-62.)。实施例3 模式菌株MIC值的测定采用96孔板法耐药株和敏感株各在20ml (100ml培养瓶)新鲜的MH液体培养基中培养24h (37 °C，200r. p. m)，使之达到稳定期。用新鲜的MH液体培养基稀释，使其终浓度为约1. 5X 105CFU/ml。再将菌液和抗菌药物加入96孔板中，反应体系总体积为100 μ 1，共选用四种抗菌药物(包括了抗菌药物的大多数作用机制)(Robert Berkow,Mark H Beers, Andrew J Fletcher. The Merck Manual of MedicalInformation—Home Edition. Merck & Co.，Inc, 1999.)，起始浓度为204. 8 μ g/ml，每种抗菌药物浓度依次2倍递减，37°C培养18 小时，观察结果。具体数值见下面的表1。表1 耐药株和敏感株摩氏摩根菌对抗菌药物MIC
权利要求
1.一种摩氏摩根菌，其保藏编号为CGMCC No. 3655，保藏日期2010年3月10日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.权利要求1所述的摩氏摩根菌在新型抗菌药物筛选中的应用。
3.一种筛选新型抗菌药物的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1所述的摩氏摩根菌。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还使用敏感型的摩氏摩根菌作为对照。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述新型抗菌药物为从微生物发酵液、植物提取液、或化合物中筛选。
6.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括初筛步骤和复筛步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，所述初筛步骤为纸片法或96孔板法。
全文摘要
本发明涉及一种摩氏摩根菌，具体地，涉及保藏编号为CGMCC No.3655的摩氏摩根菌。本发明还涉及该摩氏摩根菌在新型抗菌药物筛选中的应用，以及一种筛选新型抗菌药物的方法。
文档编号C12N1/20GK102206589SQ20101013438
公开日2011年10月5日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者关艳, 刘忆霜, 慕福琴, 甘茂罗, 肖春玲, 郑旭东, 郝雪秦 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所