专利名称：一种结核分枝杆菌药敏表型检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药敏表型检测方法及其应用，特别是涉及一种结核分枝杆菌药敏 表型检测方法及其在抗结核药物筛选中的应用。
背景技术：
结核病是一种全球性的传染性极强的疾病，每年由于结核病导致的死亡人数 达百万以上。近年来，随着多药耐药结核分枝杆菌(MDR-TB)及广泛耐药结核分枝杆菌 O(DR-TB)的出现，对结核病的治疗形成了极大的挑战(Espinal M A, Laszlo A, Simonsen L, et al. NEngl J Med. 2001,344:1294-1303)。由于 MDR-TB 和 XDR-TB 的出现，结核菌 药敏检测和耐药检测显得尤为重要，这样不仅可以更好的管理和治疗结核病人，减少耐药 菌的传播，也可以大大减少新的结核分枝杆菌耐药菌的出现，世界卫生组织认为对结核分 枝杆菌的药敏检测和耐药检测是避免结核病广泛传播的优先措施。在一些资源有限，收入较低的发展中国家，结核发病率高，MDR-TB和)(DR-TB是一 个非常严重的问题。在这些国家，结核病的药敏试验还是采用传统的固体培养基方法如罗 氏培养基(L-J medium)和米氏培养基(Middlebrook agar)法，这些方法工作量大，需要时 间长，至少需要4周时间才能知道药敏结果，这样就限制了这些传统药敏检测和耐药检测 方法的使用，许多贫困地区由于资源有限，结核病的药敏检测和耐药检测没有展开，治疗时 因为用药没有药敏检测结果的指导，从而导致了新的耐药菌的出现。目前，一些新的快速检测结核菌药敏的液体培养基方法被开发出来，但是需要昂 贵的仪器和复杂的操作技能，这对资源有限的发展中国家来说不能大规模应用。最近， 一种新的快速、经济的检测结核菌药敏的微孔板法被发现，该方法是一种快速显色法，根 据活的细菌会产生一种氧化-还原酶，把指示剂刃天青(resazurin)的颜色从蓝色还原 为红色，用肉眼就可以很明确的观察到颜色的变化，从而检测抗菌药物的最低抑菌浓度， 确定结核分枝杆菌对哪些药物敏感，对哪些药物耐药，为结核病人的合理用药提供指导 作用，经证实该方法与经典的罗氏培养基方法的检测结果一致(Juan-Carlos Palomino, Anandi Martin, Mirtha Camacho, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002,46(8):2720-2722; Anandi Martin, Mirtha Camacho, Francoise Portaels, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003, 47 (11):3616-3619； G. P. S. Jadaun, Chhaya Agarwal, Hirdesh Sharma, et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2007，60:152-155 )。这种方法简单，不需要昂贵的仪器和复杂的操作技 能，在许多收入低，资源贫乏的发展中国家可以大规模的应用。但是，这种药敏检测法有一 个严重缺点，即生物安全性较差，药敏检测人员易感染。结核分枝杆菌在96孔板培养过程 中，会产生结核菌气溶胶，药敏检测人员在加入指示剂刃天青的过程中需要打开96孔板， 结核菌气溶胶会对药敏检测人员安全构成严重威胁，从而导致结核病的实验室传播。经查 阅文献资料，能够弥补上述缺陷的结核分枝杆菌药敏检测方法及其在抗结核药物筛选中的 应用未见报道。
发明内容
针对上述药敏检测方法中的缺陷，本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌药敏表 型检测方法，包含有如下步骤
1)在无菌离心管的管盖内侧加入用甲醇溶解的质量百分浓度为0.洲的刃天青 2. 5 μ 1-6 μ 1，待甲醇挥发后，将离心管灭菌；
2)将待检测的结核分枝杆菌5-50mg接种到7H9-S培养基(购自美国BD公司)中；采用 比浊法调整菌液浓度，用无菌水或0. 9%的生理盐水将菌液浓度调至麦氏比浊1管的浓度， 再用7H9-S培养基稀释菌液20倍；
3)取稀释后的菌液50-150μ接种到步骤1)所述的离心管中；
4)在步骤3)所述的离心管中加入100μ 1用7H9-S稀释的待检测的抗结核药物溶液， 待检测药物浓度为0. 01ug/ml-2. 5mg/ml ；
5)将步骤4)所述的离心管盖紧后，于37°C培养6-7天；
6)将步骤5)所述的离心管倒置并振荡，待溶液变为蓝色后，37°C培养12-48小时。所述步骤1)中，离心管为0. 5ml、l. Oml或1. 5ml离心管，优选为0. 5ml离心管。所述步骤1)中，刃天青为4μ 1 ；灭菌为湿热灭菌，灭菌温度为121°C，灭菌时间为 20分钟。所述步骤2)中，待检测的结核分枝杆菌的接种量为30mg。所述步骤3)中，菌液为100 μ 1。所述步骤4)中，待检测的抗结核药物溶液的浓度为lmg/ml。所述步骤5)中，培养时间为7天。所述步骤6)中，培养时间为12小时。本发明的另一个目的是提供一种上述结核分枝杆菌药敏表型检测方法在抗结核 药物筛选中的应用。上述应用中，所述的抗结核药物为下述一种或几种药物，植物、动物、微生物的提 取物或发酵产物、化学合成的化学单体及其混合物或中药复方组分。实验证明，本发明提供的结核分枝杆菌药敏表型检测方法及其在抗结核药物筛选 中的应用，方法工作量小，检测时间短，与传统的罗氏培养基药敏检测法比较，准确率高达 90%-99%，且生物安全性较好，不会导致结核病的实验室传播，适合大规模的应用，具有很好 的应用前景。下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为离心管的管盖内侧上方加入刃天青甲醇溶液；
图2为离心管盖内侧的甲醇完全挥发，刃天青依然黏附在管盖内侧上方； 图3为第7天倒置离心管盒，使管盖上的刃天青溶入培养基中，作为药敏检测的指示
剂；
图4为药敏结果观察，结核临床菌株培养基颜色变为粉红色或无色，则说明该菌株对 检测药物不敏感；结核临床菌株培养基颜色不变，依然为蓝色，则说明该菌株对检测药物敏感。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的待药敏检测的三种结核分枝杆菌分别为结核菌减毒株H37Ra、结核菌有毒 株H37Rv和临床分离的结核分支杆菌菌株，其中结核菌减毒株H37Ra、结核菌有毒株H37Rv 由美国约翰-霍普金斯大学分子微生物学与免疫学研究所张颖教授提供，临床分离的结核 分支杆菌菌株由兰州市肺科医院提供。其中，所用的麦氏比浊1管的配制为常规方法，即质量浓度1%的硫酸9. 6ml中加 入质量浓度0.25%氯化钡0.細1，充分振荡后形成悬浊液。所用的7H9-S培养基由美国BD 公司购得，其组成为0. 47%的7H9、0. 2%的甘油、0. 05%的Tween80、0. 85%的氯化钠、5%的 小牛血清组分V、2%的葡萄糖和0. 003%的过氧化氢酶。实施例1、
1、0. 2%氧化还原指示剂刃天青的配制
用电子天平准确称取指示剂刃天青(resazurinMOmg放入烧杯，然后用IOml分析纯的 甲醇充分溶解，于4°C冰箱中保存备用。2、带有氧化还原指示剂刃天青的离心管的制备
如图1所示，取0. 5ml的离心管(Eppendorf公司)若干个，打开离心管的管盖，使离心 管盖与离心管垂直，将离心管插入离心管架中，然后向离心管的管盖内侧上方加入配制好 的0.洲刃天青甲醇溶液如1，在室温下使甲醇完全挥发后，如图2，放入可耐高压灭菌的铝 盒或塑料盒中，121°C湿热高压灭菌20分钟，取出备用。3、结核分枝杆菌的药敏检测
将待药敏检测的三种结核分枝杆菌分别取30mg从传统的罗氏培养基培养试管中接种 到7H9-S培养基中，用无菌水或0. 9%的生理盐水将菌液浓度调至麦氏比浊1管的浓度，然 后用7H9-S培养基稀释20倍，取IOOul菌液接种到带有刃天青的0. 5ml离心管中，再加入 100 μ 1用7H9-S稀释的利福平溶液，利福平溶液浓度为lmg/ml，然后把离心管的管盖跟离 心管严密扣住，放入离心管盒中，在恒温培养箱中37°C培养7天，加样及培养过程中液体培 养基不能与管盖上的指示剂刃天青接触，以免影响结果的观察。如图3所示，第7天时，将 离心管盒倒置，使离心管的管盖朝下，离心管身朝上，轻轻振荡，其中的7H9-S液体培养基 把离心管管盖上的氧化还原指示剂刃天青充分溶解，培养基颜色由无色变为蓝色，再放入 恒温培养箱中37°C培养12小时。4、药敏结果及抗结核药物筛选结果的观察结论
如图4所示，37°C培养12小时后，观察刃天青颜色依然为蓝色，说明利福平在此浓度下 抑制了结核菌的生长，结核菌对该药物敏感。临床试验数据结果表明，该筛选结果准确率为 90%。实施例2、
1、0. 2%氧化还原指示剂刃天青的配制
用电子天平准确称取指示剂刃天青(resazurinMOmg放入烧杯，然后用IOml分析纯的 甲醇充分溶解，于4°C冰箱中保存备用。
2、带有氧化还原指示剂刃天青的离心管的制备
取1. Oml的离心管(Eppendorf公司)若干个，打开离心管的管盖，使离心管盖与离心管 垂直，将离心管插入离心管架中，然后向离心管的管盖内侧上方加入配制好的0.洲刃天青 甲醇溶液2. 5ul，在室温下使甲醇完全挥发后，放入可耐高压灭菌的铝盒或塑料盒中，121°C 湿热高压灭菌20分钟，取出备用。3、结核分枝杆菌的药敏检测
将待药敏检测的三种结核分枝杆菌分别取5mg从传统的罗氏培养基培养试管中接种 到7H9-S培养基中，用无菌水或0. 9%的生理盐水将菌液浓度调至麦氏比浊1管的浓度，然 后用7H9-S培养基稀释20倍，取50ul菌液接种到带有刃天青的1. Oml离心管中，再加入 100 μ 1用7H9-S稀释的异烟胼溶液，异烟胼溶液浓度为0. Olug/ml，然后把离心管的管盖 跟离心管严密扣住，放入离心管盒中，在恒温培养箱中37°C培养6天，加样及培养过程中液 体培养基不能与管盖上的指示剂刃天青接触，以免影响结果的观察。第6天时，将离心管盒 倒置，使离心管的管盖朝下，离心管身朝上，轻轻振荡，其中的7H9-S液体培养基把离心管 管盖上的氧化还原指示剂刃天青充分溶解，培养基颜色由无色变为蓝色，再放入恒温培养 箱中37°C培养48小时。4、药敏结果及抗结核药物筛选结果的观察
37°C培养48小时后，观察刃天青颜色依然为蓝色，说明异烟胼在此浓度下抑制了结核 菌的生长，结核菌对该药物敏感。临床试验数据结果表明，该筛选结果准确率为99%。实施例3、
1、0. 2%氧化还原指示剂刃天青的配制
用电子天平准确称取指示剂刃天青(resazurinMOmg放入烧杯，然后用IOml分析纯的 甲醇充分溶解，于4°C冰箱中保存备用。2、带有氧化还原指示剂刃天青的离心管的制备
取1. 5ml的离心管(Eppendorf公司)若干个，打开离心管的管盖，使离心管盖与离心管 垂直，将离心管插入离心管架中，然后向离心管的管盖内侧上方加入配制好的0.洲刃天青 甲醇溶液6ul，在室温下使甲醇完全挥发后，放入可耐高压灭菌的铝盒或塑料盒中，121°C湿 热高压灭菌20分钟，取出备用。3、结核分枝杆菌的药敏检测
将待药敏检测的三种结核分枝杆菌分别取50mg从传统的罗氏培养基培养试管中接种 到7H9-S培养基中，用无菌水或0. 9%的生理盐水将菌液浓度调至麦氏比浊1管的浓度，然 后用7H9-S培养基稀释20倍，取150ul菌液接种到带有刃天青的1. Oml离心管中，再加入 ΙΟΟμ 1用7H9-S稀释的链霉素溶液，链霉素溶液浓度为2. 5mg/ml，然后把离心管的管盖跟 离心管严密扣住，放入离心管盒中，在恒温培养箱中37°C培养7天，加样及培养过程中液体 培养基不能与管盖上的指示剂刃天青接触，以免影响结果的观察。第7天时，将离心管盒倒 置，使离心管的管盖朝下，离心管身朝上，轻轻振荡，其中的7H9-S液体培养基把离心管管 盖上的氧化还原指示剂刃天青充分溶解，培养基颜色由无色变为蓝色，再放入恒温培养箱 中37°C培养24小时。4、药敏结果及抗结核药物筛选结果的观察
37°C培养M小时后，观察刃天青颜色依然为蓝色，说明链霉素在此浓度下抑制了结核菌的生长，结核菌对该药物敏感。临床试验数据结果表明，该筛选结果准确率为95%。
权利要求
1.一种结核分枝杆菌药敏表型检测方法，包含有如下步骤1)在无菌离心管的管盖内侧加入用甲醇溶解的质量百分浓度为0.洲的刃天青 2. 5 μ 1-6 μ 1，待甲醇挥发后，将离心管灭菌；2)将待检测的结核分枝杆菌5-50mg接种到7H9-S培养基中；采用比浊法调整菌液浓 度，用无菌水或0. 9%的生理盐水将菌液浓度调至麦氏比浊1管的浓度，再用7H9-S培养基 稀释菌液20倍；3)取稀释后的菌液50-150μ接种到步骤1)所述的离心管中；4)在步骤3)所述的离心管中加入100μ1用7H9-S稀释的待检测的抗结核药物溶液， 待检测药物浓度为0. 01ug/ml-2. 5mg/ml ；5)将步骤4)所述的离心管盖紧后，于37°C培养6-7天；6)将步骤5)所述的离心管倒置并振荡，待溶液变为蓝色后，37°C培养12-48小时。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，离心管为0.5ml、1. Oml或 1. 5ml离心管，优选为0. 5ml离心管。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，刃天青为4μ 1 ；灭菌为湿热 灭菌，灭菌温度为121°C，灭菌时间为20分钟。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，待检测的结核分枝杆菌的接 种量为30mg。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，菌液为100μ 1。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，待检测的抗结核药物溶液的 浓度为lmg/ml。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，培养时间为7天。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤6)中，培养时间为12小时。
9.如权利要求1-8任一所述的结核分枝杆菌药敏表型检测方法在抗结核药物筛选中 的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗结核药物为下述一种或几种药物， 植物、动物、微生物的提取物或发酵产物、化学合成的化学单体及其混合物或中药复方组 分。
全文摘要
本发明公开了一种结核分枝杆菌药敏表型检测方法，包含有如下步骤1)在无菌离心管的管盖内侧加入用甲醇溶解的质量百分浓度为0.2%的刃天青2.5μl-6μl，待甲醇挥发后，将离心管灭菌；2)将待检测的结核分枝杆菌5-50mg接种到7H9-S培养基中；采用比浊法调整菌液浓度，用无菌水或0.9%的生理盐水将菌液浓度调至麦氏比浊1管的浓度，再用7H9-S培养基稀释菌液20倍；3)取稀释后的菌液50-150μl接种到步骤1)所述的离心管中；4)在步骤3)所述的离心管中加入100μl用7H9-S稀释的待检测的抗结核药物溶液,待检测药物浓度为0.01μg/ml-2.5mg/ml；5)将步骤4)所述的离心管盖紧后，于37℃培养6-7天；6)将步骤5)所述的离心管倒置并振荡，待溶液变为蓝色后，37℃培养12-48小时。实验证明，本发明提供的结核分枝杆菌药敏表型检测方法及其在抗结核药物筛选中的应用，方法工作量小，检测时间短，与传统的罗氏培养基药敏检测法比较，准确率高达90%-99%，且生物安全性较好，不会导致结核病的实验室传播，适合大规模的应用，具有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/04GK102146430SQ20111002962
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者张颖, 汪月, 田丽丽, 祝秉东, 高娃 申请人:兰州大学