一种抗egfr人源化抗体l3-h3及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：一种抗egfr人源化抗体l3-h3及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗EGFR人源化抗体L3-H3及其编码基因与应用。
背景技术：
表皮生长因子受体(印idemic growth factor receptor, EGFR)是表皮生长因子基因(erbB)家族的一员，在约30%的人体肿瘤中过度表达，尤其是非小细胞型肺癌、头颈部鳞状细胞癌和结直肠癌等。国内外许多研究表明，针对EGFR的抗体可有效地在胞外通过阻断配体的结合来实现对EGFR信号转导途径的抑制，对多种由EGFR过度表达或/和突变所引起的人体肿瘤，尤其是头颈部鳞状细胞癌(80% 100%)，结直肠癌(25% 77%)， 非小细胞型肺癌(40% 80%)等有较好的疗效。表皮生长因子受体成为目前研究较深入且倍受关注的肿瘤治疗靶点之一，应用基因工程研制抗EGFR的单克隆抗体，成为肿瘤免疫治疗的研究热点之一。2004、2006年，美国FDA先后批准了针对EGFR的鼠-人嵌合抗体西妥昔单抗 (cetuximab)和全人抗体帕尼单抗(panitumumab)，用于结直肠癌治疗；2005年，抗EGFR的人源化抗体尼莫珠单抗(nimotuzumab)获得了我国药监局(SFDA)批准的一类新药证书，目前正在进行Π/ΙΙΙ期临床试验。鼠源单抗在人体应用中可产生人抗鼠抗体反应，从而影响其功能的发挥。采用基因工程技术改造的鼠_人嵌合抗体可大幅度减弱鼠单抗的免疫原性、延长抗体在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理及ADCC效应，进而增强抗体的生物学效应，但该嵌合抗体结合抗原的能力低于鼠源抗体98. %。大量临床前及临床试验均已证实西妥昔单抗单药及联合化疗/放疗具有较好的疗效，但简单CDR移植往往会引起抗原抗体亲和力的下降；帕尼单抗是采用转基因小鼠技术制备的全人抗体，与嵌合抗体和人源化抗体相比，人源序列接近100%，大大增强了抗体靶亲和力，但该抗体具有鼠糖基化模式、半衰期短和超敏反应更多等缺点。尼莫珠单抗则通过对抗EGFR鼠源单抗进行人源化改造获得了人源化抗体，并把抗体的轻、重链基因分别连接至不同的表达载体进行表达，由于轻重链表达存在较大差异，往往导致完整抗体分子表达水平极低。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗体及其编码基因。本发明所提供的抗体，由轻链和重链构成，所述重链由重链可变区和重链恒定区连接而成；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO :3中第1-145位所示；所述重链恒定区为人源抗体IgGl的重链恒定区；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。上述抗体的重链的氨基酸序列具体可如SEQ ID NO 3所示。上述抗体的轻链的编码基因为如下I)、II)或III)所示I)其核苷酸序列如SEQ ID NO 2中第85-726位所示或SEQ ID NO 2中第9-729 位所示；II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分 子；
III)与I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述轻链的DNA分子；上述抗体的重链的编码基因为如下1)、2)或3)所示1)其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示； 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重链的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述重链的DNA分子。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒也属于本发明的保护范围。上述重组载体具体可为按照包括如下步骤的方法制备得到的重组表达载体将所述轻链的编码基因沿着从Nhe I酶切位点至EcoRI酶切位点的方向插在载体pIRES的Nhe I和EcoRI酶切位点间，得到重组载体，记作中间重组载体；将所述重链的编码基因沿着从 Xba I酶切位点至Not I酶切位点的方向插在所述中间重组载体的Xba I和Not I酶切位点间，得到的重组载体即为目的重组表达载体。上述重组细胞具体可为将上述重组表达载体导入出发细胞得到的重组细胞；其中，所述出发细胞为293T细胞。制备上述任一所述抗体的方法也属于本发明的保护范围。制备上述任一所述抗体的方法可包括如下步骤培养上述重组细胞，收集上清液， 即得到所述抗体。在培养重组细胞的过程中，所述抗体的轻链和抗体的重链分别表达，抗体的轻链和抗体的重链自组装成为所述抗体。本发明的另一个目的是提供一种抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂。本发明所提供的抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂，其活性成分为上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒。本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂。本发明所提供的抑抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂，其活性成分为上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒。本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗肿瘤的产品。本发明所提供的预防和/或治疗肿瘤的产品，其活性成分为上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒。上述抑制剂或产品中，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为SW480细胞。上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒在制备抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为SW480细胞。本发明的最后一个目的是提供一种蛋白质片段及其编码基因。本发明所提供的蛋白质片段的氨基酸序列如SEQ ID NO 3中第1_145位所示；
本发明所提供的蛋白质片段的编码基因为如下a)、b)或c)所示a)其核苷酸序列如SEQ ID NO 4中第1_435位所示；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质片段的DNA分子；c)与a)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述蛋白质片段的DNA分子。实验结果证实，本发明抗体具有良好的抗原结合活性和抑制肿瘤细胞生长迁移侵袭能力；而国外市场上常见抗EGFR人-鼠嵌合抗体西妥昔单抗的亲和力1. 1X10_9M。本发明的人源化抗体能更好与EGFR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法， 能够同时表达轻链和重链，使轻链和重链的表达比例更接近1 1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。综上所述，本发明抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。


图1轻链基因、重链可变区基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。图2含有本发明抗体的表达载体的结构示意图。图3本发明抗体的还原型SDS-PAGE检测。图4本发明抗体的免疫印记分析。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pIRES双表达载体购自Clontech公司，产品目录号为631605 ;pMD18_T表达载体购自 Takara Bio Company，产品目录号为:D504CA.载体pIRES-Anti-⑶20在文献“《抗⑶20嵌合抗体的表达和活性检测》，中国生物工程杂志(china biotechnology), 2005, 25 (7) =34-39. ”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。实施例1、抗体的轻链和重链可变区编码基因的获得根据计算机模拟，以鼠_人嵌合抗体西妥昔单抗氨基酸序列为模板，对其鼠源FR 表面基因进行人源化改造而设计合成轻链氨基酸序列和重链“可变区+重链恒定区1”的氨基酸序列。本发明抗体由轻链L3和重链H3构成；重链H3由重链可变区(VH)、重链恒定区1 (CHl)、铰链区、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)组成(H3 = VH+CHl+hinge+CH2+CH3)。将本发明抗体记作 L3-H3。轻链L3 氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；编码基因序列如SEQ ID NO 2中第 85-726位所示；

重链H3 氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示；编码基因序列如SEQ ID NO 4所示；SEQ ID NO :3中第1-145位氨基酸为重链可变区(VH)，第146-243位氨基酸为重链恒定区1 (CHl)，第244-258位氨基酸为铰链区(hinge)，第259-369位氨基酸为重链恒定区2 (CH2)，第370-475位氨基酸为重链恒定区3 (CH3)。
SEQ ID NO 4中第1_435位核苷酸为重链可变区(VH)，第436-729位核苷酸为重链恒定区1 (CHl)，第730-739位核苷酸为剪接供体，第740-1117位核苷酸为内含子1，第 1118-1162位核苷酸为铰链区(hinge)，第1163-1280位核苷酸为内含子2，第1281-1613位核苷酸为重链恒定区2 (CH2)，第1614-1710位核苷酸为内含子3，第1711-2031位核苷酸为重链恒定区3 (CH3)，第2032-2230位核苷酸为内含子4。重链Hl的“可变区+恒定区1” 编码基因序列如SEQ ID NO 5所示。轻链L3的编码基因由人工合成得到(即人工合成SEQ ID NO 2中第9_729位核苷酸)。重链H3的“恒定区2+恒定区3”的编码基因(即SEQ ID NO :4中第730-2230位核苷酸)可人工合成得到，也可酶切载体pIRES-Anti-⑶20得到。重链H3的“可变区+恒定区1”的编码基因可由人工合成得到，也可按照如下方法得到人工合成SEQ ID NO :5所示编码基因。以人工合成的SEQ ID NO :5所示编码基因为模板，采用重叠PCR方法，由引物1、2、3、4、5、6扩增，得到重链H3的“可变区+恒定区1”的编码基因；1和3是一对引物，4和5是一对引物，6和2是一对引物，各扩增出一个片段(命名为A、B 、C)，然后，将扩增出的A、B、C混合为模板，以1和2引物扩增出目的重链H3 “可变区+恒定区1”编码基因。1 :5，-gtgtctagagccgccaccatggactgga-3‘ (XbaI) ； (SEQ ID NO 6)2:5，-gKgatccacttacctgttgctttct-3‘ (BamHI) ； (SEQ ID NO 7)3 5，-atccactcaagtctttgtccaggggcctgtcgcacccagtggacgccgtagttagtcaggctgaatccag-3， ；(SEQ ID NO :8)4 5，-gagtggatgggagtgatctggagtggtggtaacactgactacaacacccccttcactagcagagtcacc-3，。(SEQ ID NO 9)5 5，-gaccagggttccctggccccagtaggcgaactcgtagtcgtaataagtcagggctctcgcacag-3 ，(SEQ ID NO 10)6 5' -cctactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcg-3' (SEQ ID NO 11).将得到的各基因进行凝胶电泳检测，结果与预期大小一致，轻链L3的片段大小约为720bp，重链H3的“可变区+恒定区1”的编码基因大小约为729bp (图1)。M.相对分子质量标准；A 泳道1为轻链L3的编码基因；B 泳道1为重链Hl的“可变区+恒定区1”基因、泳道3为重链H3的“可变区+恒定区1”基因。将获得的轻链编码基因和重链H3的“可变区+恒定区1”编码基因分别克隆入 PMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆、提取质粒并测序鉴定。结果表明，pMD18_T 载体中插入了 SEQ ID NO 2中第9-729位(即轻链编码基因)核苷酸所示DNA，将该重组载体记作pMD18-T/L3。pMD18-T载体中插入了 SEQ ID NO 4中第1-729位(即重链H3的 “可变区+恒定区1，，编码基因)核苷酸所示DNA，将该重组载体记作pMDIS-T/VH+CHI。
实施例2、抗体的表达与纯化一、重组表达载体的构建将重组载体pMD18-T/L3和pIRES双表达载体分别用相应的限制性内切酶(Nhe I 和EcoRI)酶切，琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段；将轻链基因片段L3与载体片段混勻，在连接试剂的作用下，16°C反应12h。转化大肠杆菌DH5a，挑单克隆、提取质粒并测序鉴定，结果在载体PlRES的Nhe I和EcoRI酶切位点间(沿着从Nhe I酶切位点至EcoRI酶切位点的方向)插入了 SEQ ID NO 2中第9-729位核苷酸所示轻链编码基因，表明构建的重组载体正确，记作重组表达载体PIRES/L3。以pIRES/L3为模板，用XbaI和Not I酶切，回收质粒大片段，记作片段1 ；以 PMD18-T/VH+CH1为模板，用Xba I和BamH I酶切，回收729bp左右的片段(即重链H3的 “可变区+恒定区1”片段)，记作片段2;以pIRES-Anti-⑶20为模板，用BamH I和Not I 酶切，回收1502bp左右片段(即含有“重链恒定区2+恒定区3”片段)，记作片段3 ；将片段1、2和片段3连接，得到重组载体，转化大肠杆菌DH5a，挑单克隆、提取质粒并测序鉴定。 结果表明，在载体PlRES的Xba I和Not I酶切位点间(沿着从XbaI至Not I的方向)插入了 SEQ ID NO 4所示重链编码基因，在载体pIRES的EcoRI和Nhe I酶切位点间(沿着从Nhe I至EcoRI的方向)插入了 SEQ ID NO 2中第9-729位核苷酸所示轻链编码基因， 在轻链编码基因和重链编码基因之间为IRES(Internal ribosome entry site，内部核糖体进入位点序列，IRES能独立地招募核糖体对重链mRNA进行翻译)。将阳性重组表达载体记作 pIRES/L3/H3(图 2)。二、载体转化及抗体的表达293T细胞(293T人胚肾T细胞)购自美国菌种保藏中心(又称美国模式菌种收集中心，ATCC)，产品目录号为 CRL-11268 ；Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen 公司，产品目录号为12566014 ；HyQSFM4CH0培养基购自HyClone公司，产品目录号为SH30518. 02 ； rProtein A层析柱购自GE公司，产品目录号为17-5079-01。将293T细胞按IX 106/ml分别接种于直径为IOcm的培养皿中，培养皿中装有含10%胎牛血清的DMEM培养基，37°C、5% CO2孵箱，培养。取5 μ g步骤一中得到的质粒 PIRES/L3/H3转染293T细胞，具体操作参照Lipofectamine 2000的试剂说明。得到重组细胞 293T-pIRES/L3/H30将重组细胞293T-pIRES/L3/H3用无血清DMEM培养基培养，培养6 8h后吸出无血清培养基，代之以HyQSFM4CH0培养基。相同条件下继续共培养84h，间隔12h收取一次细胞上清，用ELISA法初步检测抗体的表达。扩大转染体系，收集细胞培养上清4 5L，调pH 至6. O 7. 0，用0. 45 μ m滤膜过滤，再用rProtein A层析柱纯化抗体，具体操作参见产品说明书。ELISA法用于检测未知抗原的双抗体夹心法1.包被用0. 05M PH9. O碳酸盐包被缓冲液将抗体(一抗为山羊抗人IgG)稀释至蛋白质含量为1 lOyg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0. lml，4°C过夜。次日， 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2.加样加一定稀释的待检样品0. Iml于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育1 小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔(未转染质粒的293T细胞上清)及阳性对照孔(西妥昔单抗注射液(Erbitux)，进口药品注册证号S20050095。德国默克公司，产品批号:7667201o )。3.加酶标抗体(二抗为山羊抗人IgG-HRP (山羊抗人IgG-辣根过氧化物酶))于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0. lml。37°C孵育0.5 1小时，洗涤。

4.加底物液显色于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0. Iml, 37°C 10 30分钟。5.终止反应于各反应孔中加入2M硫酸0. 05ml。6.结果判定可于白色背景上，直接用肉眼观察结果反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ + ”、“-”号表示。也可测OD值 在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若大于规定的阴性对照OD值的2. 1倍，即为阳性。试剂(1)包被缓冲液(PH9. 60. 05M碳酸盐缓冲液)=Na2CO3L 59克，NaHC032. 93克，加蒸馏水至1000ml。(2)洗涤缓冲液(PH7. 4PBS) 0. 15M =KH2PO4 0. 2 克，Na2HPO4 · 12H20 2. 9 克，NaCl 8. 0 克，KCl 0. 2 克，Tween-200. 05% 0. 5ml，加蒸溜水至 1000ml。(3)稀释液牛血清白蛋白(BSA)O. 1克加洗涤缓冲液至IOOml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5 10%使用。(4)终止液(2M H2S04)蒸馏水178. 3ml，逐滴加入浓硫酸(98% )21. 7ml。磷酸钠盐缓冲液(结合缓冲液)用作ProteinA纯化的结合缓冲液。配制方法为取IM Na2HPO4 57. 7ml和IM NaH2PO4 42. 3ml混勻，即为0. IM pH7. 0的磷酸钠盐缓冲液 100ml，再用蒸馏水稀释至20mM备用。柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(洗脱缓冲液)用作ProteinA纯化的洗脱缓冲液。配制方法为取0. IM柠檬酸186ml和0. IM柠檬酸钠14ml混勻，即为0. 1Μ、ρΗ3· 0的柠檬酸盐缓冲液200ml。用rProtein A层析柱纯化抗体纯化介质HiTrap rProtein A FF，5ml，购自GE 公司，目录号17-5079-01，详细使用说明书请参阅其公司提供的说明书。操作1)清洗，用IM NaOH和ddH20先后清洗管道，将小滤器用0. IM NaOH煮沸IOmin后再用ddH20浸泡1 2min ；2)设定程序，连接rProtein A亲和层析柱；3)用20mM结合缓冲液(pH7. 0)平衡层析柱；4)将已制备好的细胞上清以1 2ml/min的流速上样；细胞上清制备以12000g 离心15分钟，取出上清，经过0. 22um硝酸纤维素滤膜过滤除菌。5)上样将要结束时用IM洗脱缓冲液(pH3. 0)洗脱目的蛋白；6)收集洗脱液(即目的蛋白)，用Trise碱(pH9. 0)将其pH调至7. 0，电泳检测；7)按步骤1)清洗管道和小滤器。三、蛋白检测
山羊抗人IgG-HRP抗体购自Sigma公司，产品目录号为(046K4801)；山羊抗鼠 IgGl 购自 SBA(Southern Biotechnology Associates, Inc.)，产品目录号为(1010-05)；SDS-PAGE 取15 μ 1洗脱液(即抗体溶液)在12%凝胶上进行还原SDS-PAGE电泳，用考马斯亮兰R-250染色。结果显示，纯化所得抗体的重链与轻链的相对分子质量分别为25Χ103、 50 X IO3 (图3)，与预期结果一致。图3中，泳道1-4表示本发明抗体L3-H3，泳道5表示阳性对照西妥昔单抗。免疫印迹分析另取洗脱液在12%凝胶上进行非还原SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，取出膜用封闭液(含有5%脱脂奶粉的1XPBST)在室温封闭2h，用1 5000 稀释的羊抗人IgG-HRP抗体与之孵育2h (室温)，再用1 XPBST洗膜3次。最后用ECL显色，用X线片进行曝光。图4中，泳道1表示阳性对照西妥昔单抗；泳道2-5表示本发明抗体 L3-H3。 免疫印记(12%)分析表明，该抗体可与山羊抗人IgG特异性结合。但是也出现了部分与抗人IgG 二抗反应的一些非特异杂交带(包括商品化的西妥昔单抗)，这可能是纯化中有部分非全长的重链片段混合所至。但是上述结果不影响抗体亲和力的评价。上述抗体均不与山羊抗鼠IgGl反应。由于本抗体的轻链和重链在一个表达载体上，成比例表达，自动组成含两条轻链和重链的完整抗体。四、蛋白表达量按照步骤一和二中方法获得表达抗体L3-H3的细胞培养上清4 5L，用rProtein A层析柱纯化抗体，检测抗体在293T细胞中的表达量，结果为0. 35μ g/ml洗脱液。实施例3、抗体的功能一、Biacore检测抗体与抗原的结合能力Sensor Chip CM5 购自 BD 公司，产品目录号为 Br-1000-14 ;BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber 购自 BD 公司，产品目录号为 354480.EGFR蛋白购自Sigma公司，产品目录号E2645-500UN。用Biacore3000设备测定抗体与EGFR的亲和力。配制不同pH值(4. 0，4. 5，5. 0 和5. 5)的10mmol/L NaAc稀释EGFR蛋白，在CM5芯片上做预浓缩，选择最适pH值的NaAc 稀释蛋白。将纯化的抗体(即实施例2中步骤二得到的洗脱液)共价偶联于CM5传感芯片上，流动相为HBS-EP (pH7. 4)，流速20 μ 1/min，取五种浓度的抗体(0，10. 55，21. 1,42. 2禾口 84. 4nmol/L)与EGFR蛋白结合亲和力的检测。亲和力用BiaCOre3000附带软件计算。同时以西妥昔单抗为对照。实验设3次重复，结果取平均数。结果显示抗体对抗原EGFR具有良好的结合活性，亲和力为1. 18X10_9M。西妥昔单抗的亲和力为1. 1X10_9M。结果表明本发明人源化抗体保持了亲本良好的结合活性，克服了鼠源抗体的不良反应，具有很好的临床应用价值。二、肿瘤细胞侵袭实验SW480细胞购自美国菌种保藏中心(又称美国模式菌种收集中心，ATCC)，产品目录号为(ATCC Number :CCL-228 )；西妥昔单抗抗体购自德国默克里昂制药公司(原产地英文商品名ERBITUX ；原产地英文药品名=Cetuximab ；中文参考商品译名爱必妥；分子结构名西妥昔单抗；产地国家德国；生产厂家德国默克里昂制药公司)。 用RPMI1640培养基(购自Invitrogen公司，目录号为31800-022)培养SW480细胞。用无血清RPMI1640培养基水化侵袭室(invasion chamber)，孵育2h (37°C，5% CO2)。 弃无血清 RPMI1640，在侵袭室(BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber 购自 BD 公司， 产品目录号为354480)的孔室加入750 μ 1 RPMI 1640 (含10%血清)；在插入(insert)室中加入475 μ 1 RPMI 1640(含血清)，然后向其中加入25μ1消化的SW480细胞(细胞数> 105/500 μ 1)，最后分别向插入室中加入阴性对照PBS和本发明抗体，每个样品均有两个复孔，抗体终浓度均为lOOng/ml。孵育24h后，将未能穿透侵袭盒基底膜的细胞用无菌棉签擦去；穿透基底膜的细胞固定、染色、室温晾干后，光镜计数。统计学处理在100倍显微镜下计算每个插入室中样品的相应3组细胞数。运用 SPSS12. 0统计软件对细胞侵袭实验数据进行t检验，将本发明抗体与人IgG组比较。若结果为P < 0. 05，两种处理效果差异有统计学意义。实验设3次重复，结果取平均数。t检验分析结果显示(表1)人IgG组与本发明抗体组的P值小于0. 01，抗EGFR抗体与对照组人IgG组相比，差异显著，对SW480肿瘤细胞的侵袭具有显著的抑制作用。表1、细胞侵袭实验的t检测结果
权利要求
1.一种抗体，由轻链和重链构成，所述重链由重链可变区和重链恒定区连接而成；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 3中第1-145位所示；所述重链恒定区为人源抗体IgGl的重链恒定区；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQID NO 3所示。
3.权利要求1或2所述抗体的编码基因；或，所述轻链的编码基因为如下I)、II)或III)所示I)其核苷酸序列如SEQID NO 2中第85-726位所示或SEQ ID NO 2中第9-729位所示；II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；III)与I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述轻链的DNA分子；或，所述重链的编码基因为如下1)、2)或3)所示1)其核苷酸序列如SEQID NO 4所示；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重链的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述重链的DNA分子。
4.含有权利要求3所述编码基因的重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为按照包括如下步骤的方法制备得到的重组表达载体将所述轻链的编码基因沿着从Nhe I酶切位点至EcoRI 酶切位点的方向插在载体PlRES的Nhe I和EcoRI酶切位点间，得到重组载体，记作中间重组载体；将所述重链的编码基因沿着从Xba I酶切位点至Not I酶切位点的方向插在所述中间重组载体的Xba I和Not I酶切位点间，得到的重组载体即为目的重组表达载体。
6.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于所述重组细胞是将权利要求5所述重组表达载体导入出发细胞得到的重组细胞；和/或，所述出发细胞为293T细胞。
7.制备权利要求1或2所述抗体的方法，包括如下步骤培养权利要求6所述重组细胞，收集上清液，即得到权利要求1或2所述抗体。
8.一种抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂、一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂或一种预防和/或治疗肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1或2中所述抗体、权利要求 3所述编码基因、权利要求4或5中所述重组载体、权利要求4所述重组菌、权利要求4或6 中所述重组细胞和/或权利要求4中所述表达盒；和/或，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为SW480细胞。
9.权利要求1或2中所述抗体、权利要求3所述编码基因、权利要求4或5中所述重组载体、权利要求4所述重组菌、权利要求4或6中所述重组细胞和/或权利要求4中所述表达盒在制备抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂中的应用；权利要求1或2中所述抗体、权利要求3所述编码基因、权利要求4或5中所述重组载体、权利要求4所述重组菌、权利要求4或6中所述重组细胞和/或权利要求4中所述表达盒在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用；权利要求1或2中所述抗体、权利要求3所述编码基因、权利要求 4或5中所述重组载体、权利要求4所述重组菌、权利要求4或6中所述重组细胞和/或权利要求4中所述表达盒在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用；和/或，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为SW480细胞。
10. 一种蛋白质片段及其编码基因；所述蛋白质片段的氨基酸序列如SEQ ID NO 3中第1-145位所示； 所述蛋白质片段的编码基因为如下a)、b)或c)所示a)其核苷酸序列如SEQID NO 4中第1-435位所示；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所 述蛋白质片段的DNA分子；c)与a)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述蛋白质片段的DNA分子。
全文摘要
本发明公开了一种抗EGFR人源化抗体L3-H3及其编码基因与应用。该抗体由轻链和重链构成，所述重链由重链可变区和重链恒定区连接而成；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO3中第1-145位所示；所述重链恒定区为人源抗体IgG1的重链恒定区；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。实验结果证实，本发明抗体具有良好的结合活性和抑制肿瘤细胞生长迁移能力；而国外市场上常见抗EGFR人-鼠嵌合抗体西妥昔单抗的亲和力1.1×10-9M。本发明的人源化抗体能更好与EGFR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链，使轻链和重链的表达比例更接近1∶1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。综上所述，本发明抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/15GK102153647SQ20111002944
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者戴维·威孚, 曹诚, 米歇尔·瑞奇韦兹, 靳彦文 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所