一种高产率的微藻培养方法

专利名称：一种高产率的微藻培养方法
技术领域：
本发明属于生物能源领域和/或微藻生物技术领域，涉及一种高产率的微藻培养方法。
背景技术：
微藻细胞内富含蛋白质、多糖、脂肪酸和类胡萝卜素等多种高价值活性物质。因此，目前微藻在食品、饲料、医药、环保和生物能源等诸多方面具有广泛的应用。微藻的主要培养方式有光自养、混合营养及异养培养。目前，已实现产业化应用的微藻(如小球藻、螺旋藻、盐藻、雨生红球藻等)几乎都是采用光自养方式培养。微藻的混合营养培养需要在可灭菌的光生物反应器内进行培养，需要同时保障无菌培养和充足的光照条件，对培养设备的要求极高，同时设备难以放大。因此，在实际的微藻大规模培养中几乎没有采用混合营养方式进行培养。与光自养培养相比，异养培养的藻细胞品质(如蛋白及色素含量等)低，往往难以应用。因此，在上述三种微藻培养模式中，光自养培养的藻细胞品质高，备受人们的关注。目前，研究者热衷于采用微藻光自养培养过程积累的油脂来生产生物柴油(Attilio Convert!, Alessandro A. Casazza, Erika Y. Ortiz, Patrizia Perego, Marco Del Borghi., Effect of temperature and nitrogen concentration on the growthand lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodeselproduction[J]. Chemical Engineering and Processing,2009,48 :1146 1151)。虽然微藻的光自养培养过程可积累大量的有用物质(如油脂、蛋白等)，但是仍存在以下3方面问题1)接种密度低导致易受到杂藻和原生动物的污染；2)目前种子扩培均采用光自养培养，其周期十分漫长(一般需要1 2个月)且容易受到污染，藻种在几个月的不断扩培中需要大量的培养装置及设备且占地面积大；幻微藻光自养培养过程细胞生长慢、目的产物的产率低。因此，本领域仍然需要一种高产率的微藻培养方法。

发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种有效的解决方法，对于可异养培养的微藻，进行藻种的异养培养，随后以异养培养所获得的藻细胞作为种子进行光自养培养。采用本发明方法可充分发挥微藻在异养阶段快速生长的优势，不仅能为微藻的大规模光自养培养及时提供大量藻种，而且还可加快微藻光自养生长和目的产物(如油脂、蛋白等)形成速率，为解决微藻大规模光自养培养过程中存在的藻种扩培周期长、细胞生长慢和目的产物产率低的问题，提供了一种重要的技术手段。因此，本发明第一方面提供一种微藻培养方法，该方法包括微藻藻种的异养培养步骤和以异养培养所获得的藻细胞作为种子实施的光自养培养步骤。本发明第二方面提供一种油脂生产方法，所述方法包括微藻藻种的异养培养步骤、以异养培养所获得的藻细胞作为种子实施的光自养培养步骤、以及藻细胞采收和油脂提取的步骤。 本发明第三方面提供一种蛋白质生产方法，所述方法包括微藻藻种的异养培养步骤、以异养培养所获得的藻细胞作为种子实施的光自养培养步骤、以及藻细胞采收和蛋白质提取的步骤。 在一个具体实施方式
中，所述的微藻选自可异养培养的微藻。在一具体实施方式
中，所述微藻选自绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻 (Chlorella vulgaris), #|0/Jn-SJc^ (Chlorella ellipsoidea), Chlorella emersonii, Chlorel la sorokiniana, Chlorel la saccharophila, Chlorella regularis, Chlorellaminutissima, Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis, 以 § ■ I、二中的 Brachiomonas submarina, Chlamydobonas reinhardtii, Chlamydomonasacidophila, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris, Scenedesmusobliquus,Spongiococcum exetriccium,Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii, Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ；娃藻门的 Cylindrotheca fusiformis, Nitzschia laevis, Nitzschia alba, Nitzschiafonticola, Navicula incerta, Navicula pelliculosa ；蓝藻门的 Anabaena variabilis ；金藻Π白勺 Poterioochromonas malhamensis ；甲藻|、二白勺 Amphidinium carterae, Crypthecodinium cohnii ；裸藻门的 Euglena gricilis ；和红藻门的 Galdieria sulphuraria。在一个具体实施方式
中，所述微藻藻种异养的步骤包括在生物反应器中加入pH 为4. O 9. O的培养基，按工作体积的0. 1 30%接入微藻藻种进行分批培养、补料分批培养或半连续培养，培养温度为10 40°C，控制pH小于9. 0，控制溶氧在以上。在一个具体实施方式
中，所述微藻光自养的步骤包括将异养能源微藻藻种接种到光自养培养装置中进行光自养，培养温度为5 50°C，连续光照或间歇光照，光照强度为 0. 1 150klx，光自养培养周期为5 500小时，初始接种密度为0. 01 10. 00克/升，pH 为 4. O 12. O。在一个具体实施方式
中，异养培养基由氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水组成；光自养培养基由氮源、无机盐和水组成。在一个具体实施方式
中，所述异养步骤在摇瓶、机械搅拌式、气升式或鼓泡式可异养培养的生物反应器中进行，所述光自养培养步骤在摇瓶或选自敞开式的跑道池或圆池、 封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱式光生物反应器、薄膜立袋或吊袋等任何可用于微藻光自养培养的装置中进行，光照条件为自然光或人工光照射。在一个具体实施方式
中，当小球藻为普通小球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成KN035 15克/升、葡萄糖10 60克/升、KH2PO4O. 3 0. 9克/升、 Na2HPO4 · 12H20 1. O 10. O 克 / 升、MgSO4 · 7Η20 0. 2 1. O 克 / 升、CaCl2O. 05 0. 3 克 /升、FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 05克/升、微量元素0. 5 細1和水，其中微量元素的组成为 H3B035 15 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 5. 0 10. 0 克 / 升，MnCl2 · H2Ol. 0 2. 0 克 / 升， (NH4)6Mo7O24 ·4Η20 0. 5 1. 5 克 / 升，CuSO4 ·5Η20 1. 0 2. 0 克 / 升，Co (NO3)2 ·6Η20 0. 1
0.9克/升。在一个具体实施方式
中，当小球藻为蛋白核小球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成葡萄糖10 60克/升，尿素2. 0 8. 0克/升，KH2PO4L 0 2. 0克/ 升，MgSO4 · 7Η20 1. 0 2. 0克/升，CaCl2O. 05 0. 1克/升，柠檬酸三钠0. 1 2. 0克/ 升，Fe-EDTA溶液0. 5 lmL，A5溶液1 5mL和水；其中!^e-EDTA溶液配方为!^eSO4 · 7H20 20 30克/升和EDTA 20 40克/升；A5溶液配方为Η3Β032· 5 4. 0克/升，MnCl2 ·4Η20
1.0 2. 0 克 / 升，ZnSO4 · 7Η20 0. 1 0. 6 克 / 升，CuSO4 · 5Η20 0. 05 0. 1 克 / 升， Na2MoO4O. 01 0. 05 克 / 升。在一个具体实施例中，当异养培养液中的葡萄糖消耗完后，结束异养培养，并将异养培养所得藻细胞作为种子实施光自养培养步骤。在本申请其它具体实施方式
中，可使用本申请所述的培养基、培养条件实施上述微藻培养方法。以小球藻藻种的异养培养和以异养培养所获得的藻细胞作为种子的光自养培养生产生物柴油为例，详细说明本发明的优点(1)可大大提高藻种培养速率。一般户外大池培养微藻的初始接种密度为0. 05 0. lg/Ι，大池的体积一般为5000L，若需满足这一要求，则需要250 500g的微藻作为种子。 若采用传统的光自养扩培藻种，则需要1 2月(藻种光自养培养10天的藻细胞密度一般为0. 2 0. 5g/l，需经过逐级扩培(约10倍左右的稀释率)最后才能进入大池)；而采用 50L发酵罐异养培养藻种，则只需2 3天。(2)与传统的藻种光自养培养相比，可减少藻种培养过程中的装置及设备数量，且占地面积小，单位培养面积(或体积)产率高。以5000L的大池光自养培养所需藻种的扩培为例，光自养扩培藻种需要5L、50L和500L的培养装置，而藻种异养培养只需50L的培养装置即可。 (3)与藻种光自养培养相比，藻种异养培养不受户外天气及环境的影响。藻种光自养培养时，若遇到阴雨天气而无法继续培养时，则需要搬入室内并添加人工光来继续光自养培养藻种，从而增加了人工光照费用。另外，藻种光自养易受到原生动物、杂藻等敌害生物的污染，从而导致藻种培养失败，严重影响生产。(4)户外大池培养时，接种量越大，越不容易受到其他杂藻或原生动物等污染；藻种的异养培养可及时提供大量种子，从而满足光自养培养时提高接种量的需求。(5)异养藻种的活力优于光自养培养的藻种。接入相同藻细胞量进行光自养培养时，利用异养培养的细胞作为藻种的光自养培养过程的藻细胞密度、油脂产率及蛋白产率等，均高于利用光自养培养的细胞作为藻种的光自养培养过程的相应值。另外，由于用异养藻种进行光自养培养所获得的藻细胞密度较高，因此，可以降低能源微藻的采收成本。综上所述，本发明的藻种的异养培养和以异养培养所获得的藻细胞作为种子的光自养培养模式可以解决光自养培养时由于藻种培养效率低且易受污染所造成的诸多问题及微藻在光自养培养过程生长速率慢且目的产物(如油脂、蛋白等)产率低的问题。因此， 本发明为解决微藻光自养培养过程中细胞生长慢和目的产物产率低的问题提供了一种重要的技术手段，特别是为利用微藻生产生物柴油的产业化奠定了重要的基础。


图1显示蛋白核小球藻种子分别在500ml摇瓶中异养培养和在2L三角瓶中光自养培养的生长过程。图2显示普通小球藻种子分别在500ml摇瓶中异养培养和在2L三角瓶中光自养培养的生长过程。图3显示椭圆小球藻种子分别在500ml摇瓶中异养培养和在2L三角瓶中光自养培养的生长过程。图4显示蛋白核小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的藻细胞生长曲线。图5显示蛋白核小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的油脂产率。图6显示普通小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的藻细胞生长曲线。图7显示普通小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的油脂产率。图8显示椭圆小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的藻细胞生长曲线。图9显示椭圆小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的油脂产率。图10显示蛋白核小球藻异养种子在户外2L光生物反应器中光自养培养的藻细胞生长曲线及最高油脂产率。图11显示蛋白核小球藻异养种子在户外60L塑料盆中光自养培养的藻细胞生长曲线及最高油脂产率。
具体实施例方式适用于本申请的微藻包括所有可进行异养培养的微藻，包括但不限于绿藻门小球藻属中的蛋白核7J^i求藻(Chlorella pyrenoidosa)，普i§/J、i求藻(Chlorellavulgaris), IPIIMI7Jn5^ (Chlorella ellipsoidea), Chlorella emersonii, Chlorellasorokiniana, Chlorella saccharophila, Chlorella regularis, Chlorella minutissima, Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis,以及 t录藻 |、二中白勺 Brachiomonassubmarina， Chlamydobonas reinhardtii, Chlamydomonas acidophila, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris, Scenedesmus obliquus, Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii, TetraseImistetrathele, Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ； 娃藻门的 Cylindrotheca fusiformis, Nitzschia laevis, Nitzschia alba, Nitzschia fonticola, Navicula incerta, Navicula pelliculosa ；蓝藻门的 Anabaena variabilis ；金藻门的 Poterioochromonas malhamensis ；甲藻门的 Amphidinium carterae, Crypthecodinium cohnii ；裸藻门的Euglena gricilis ；红藻门的 Galdieriasulphuraria。在优选的实施方式中，本发明采用小球藻实施。在更优选的实施方式中，本发明采用蛋白核小球藻、普通小球藻或椭圆小球藻来实施。在其它优选实施例中，本发明采用蛋白核小球藻、普通小球藻或椭圆小球藻来实施高油脂产率和高蛋白产率的微藻培养。可采用本领域熟知的各种培养基来进行微藻种子的异养培养。通常，异养培养基含有氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水。适用于微藻培养的氮源、有机碳源、无机盐、微量元素等是本领域周知的。例如，作为氮源，可使用的有尿素或各种硝酸盐，如KNO3等；作为有机碳源，可使用葡萄糖、蔗糖、甘油等。这类培养基包括HA-SK培养基(中国专利ZL 200610024004.9)、 Endo 培养基(Ogbonna J. C. , Masui. H. , Tanaka. H. Sequential heterotrophic autotrophiccultivation-an efficient method of producing Chlorella biomass for health foodand animal feed. J. Appl. Phycol. 1997,9, 359 ~ 366)等。本发明所用的HA-SK培养基基本上是由KNO3、葡萄糖以及无机盐、微量元素和水组成。在所述技术方案中，所述微量元素宜选自H3BO3, ZnSO4 · 7H20, MnCl2 · H2O, (NH4)6Mo7O24 · 4H20，CuSO4 · 5H20，Co (NO3)2 · 6H20 中的一种或多种或全部。术语“基本上是由……组成”表示上述培养基中除了含有主要组分KNO3、葡萄糖以及无机盐、微量元素和水外，还可包含一些对于组合物的基本特性或新的特性(即可维持微藻在较短的培养周期内细胞密度达到较高的水平，同时活性物质含量与常规异养培养相比有较大幅度提高)没有实质上影响的组分。术语“由……组成”表示上述培养基由所指出的具体组分组成，没有其他组分，但是可以带有含量在通常范围内的杂质。在该培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对微藻细胞密度和品质有很大的实质影响。因此，这些组分的用量不应受实施例的严格限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基中还可加入无机盐，例如硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和磷酸盐等，以及微量元素如 Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co 等。在本发明中，较佳的微量元素组分宜选自H3BO3, ZnSO4 · 7H20, MnCl2 · H2O, (NH4)6Mo7O24 · 4H20, CuSO4 · 5H20, Co (NO3)2 · 6H20中的一种或多种。无机盐和微量元素的用量可根据常规知识确定。本发明所采用的HA-SK培养基基本上由以下成分组成KN035 15克/升、葡萄糖 10 60 克 / 升、KH2PO4O. 3 0. 9 克 / 升、Na2HP04 · 12H20 1. 0 10. 0 克 / 升、MgSO4 ·7Η20 0. 2 1. 0 克 / 升、CaCl2O. 05 0. 3 克 / 升、FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 05 克 / 升、微量元素 0. 5 4ml和水，其中微量元素的组成为H3B035 15克/升，ZnSO4 · 7H20 5. 0 10. 0克/ 升，MnCl2 .H2O 1. 0 2. 0 克 / 升，(NH4) 6Μο7024 · 4Η200· 5 1· 5 克 / 升，CuSO4 ·5Η20 1. 0 2. 0 克 / 升，Co (NO3) 2 · 6Η20 0. 1 0. 9 克 / 升。在一个较佳的实施方案中，本发明的HA-SK培养基组合物宜由以下成分组成 ΚΝ037 克 / 升、葡萄糖 40 克 / 升、KH2PO4O. 6 克 / 升、Na2HPO4 · 12Η20 2. 0 克 / 升、MgSO4 ·7Η20
0.8 克 / 升、CaCl2O. 2 克 / 升、FeSO4 · 7Η20 0. 03 克 / 升、微量元素 1. 5mL 和水 IOOOmL,其中微量元素的组成为H3BO3Il 12克/升，ZnSO4 · 7H20 8. 5 9. 5克/升，MnCl2 · H2O
1.4 1. 5 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4Η200· 8 0. 9 克 / 升，CuSO4 · 5Η20 1. 5 1. 6 克 / 升， Co (NO3) 2 · 6Η20 0. 45 0. 55 克 / 升。
本发明所用的Endo培养基基本上由以下成分组成葡萄糖10 60克/升，尿素 2 8 克 / 升，KH2PO4I 2 克 / 升，Nei2HPO4 ·12Η20 1. 0 10. 0 克 / 升，MgSO4 ·7Η201 2 克 /升，CaCl2O. 05 0. 1克/升，柠檬酸三钠0. 1 2. 0克/升，Fe-EDTA溶液0. 5 ImL, Α5 溶液1 5mL和水；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4 ·7Η20 20 30克/升和EDTA 20 40 克 / 升；Α5 溶液配方为 Η3Β032· 5 4. 0 克 / 升，MnCl2 · 4H201. 0 2. 0 克 / 升，ZnSO4 · 7Η20 0. 1 0. 6 克 / 升，CuSO4 · 5Η20 5 10 克 / 升，Na2MoO4O. 01 0. 05 克 / 升。在一个较佳的实施方案中，所述Endo培养基由以下成分组成葡萄糖40克/升， 尿素 6. 0 克 / 升，KH2PO4L 5 克 / 升，Na2HP04 · Iffl2O 5. 0 克 / 升，MgSO4 · 7Η201· 8 克 / 升， CaCl2O. 05克/升，柠檬酸三钠0. 4克/升，Fe-EDTA溶液0. 8mL, A5溶液2. OmL和水，其中 Fe-EDTA溶液配方为FeSO4 · 7H20 25克/升和EDTA33. 5克/升，A5溶液配方为Η3Β032· 86 克 / 升，MnCl2 · 4Η20 1. 81 克 / 升，ZnSO4 · 7Η20 0. 222 克 / 升，CuSO4 · 5Η20 0. 07 克 / 升， Na2MoO4O. 021 克 / 升。在根据上述配方配制培养基后，可用常规手段如酸或碱将所述培养基的ρΗ调为 4. 0 9. 0，并在115 120°C下高压灭菌15 20分钟。可采用分批培养、补料分批培养、 半连续培养(带放)或连续培养等四种方式实施种子异养培养。当进行种子异养培养时，将相应配制好的培养基加入到生物反应器中，补加水至工作体积，通常装料系数为0. 6 0. 8，然后蒸汽灭菌(121°C，维持约20分钟)，当温度降至 30 35°C时，按工作体积的1 15%接入微藻种子开始异养培养。无论采用何种培养方式，在培养过程中，须控制适合的培养条件使微藻种子正常生长。通常，控制温度为20 35°C，例如28 30°C，溶氧不低于5%的空气饱和浓度，ρΗ 不高于9.0。在优选的实施例中，溶氧不低于10%的空气饱和浓度，ρΗ不高于8. 5。在其它优选的实施例中，溶氧不低于15%的空气饱和浓度，ρΗ不高于8。 在培养过程中，ρΗ不宜过高或过低，一般随着培养的进行，PH会慢慢上升(对于普通小球藻此现象特别明显)，pH过高会对藻细胞生长产生不利影响，所以应用酸(例如10% 的硫酸)进行调节，使PH不高于9. 0，较佳的ρΗ应为6. 5 7. 5。异养可以在摇瓶、机械搅拌式、气升式、鼓泡式等可异养培养的生物反应器中进行。当种子异养培养液中的葡萄糖消耗完后，则种子异养培养结束。随后，接种到光自养培养装置中进行光自养培养。光自养培养的初始接种密度通常为0. 01 1克/升，温度为10 40°C，光照强度为0. 1 lOOklx，光暗周期为 6:18，pH为4. 0 9. 0，通气量为0. 05 5vvm,通入CO2浓度为0. 03 5 %。当藻细胞生长处于稳定期时(即藻细胞密度不增加时)，则结束光自养培养，对藻细胞进行采收。可采用本领域熟知的各种光自养培养基来进行光自养培养。通常，光自养培养基含有氮源、磷源、无机碳源、无机盐、微量元素和水。适用于微藻培养的氮源、磷源、无机碳源、无机盐、微量元素等是本领域周知的。例如，作为氮源，可使用的有尿素或各种硝酸盐， 如KNO3等；作为磷源，可使用的有例如NaH2PO4 ；作为无机碳源，可使用的有例如CO2等。这类培养基以F-Si培养基为基础培养基。本发明所用的改进F-Si培养基基本上是由NaN03、NaH2PO4以及微量元素、少量维生素和水组成。在所述技术方案中，所述微量元素宜选自I^eC6H5O7 · 5H20, ZnSO4 · 7H20, MnCl2 · H2O, Na2MoO4 · 2H20, CuSO4 · 5H20, Na2EDTA, CoCl2 中的一种或多种或全部。术语“基本上是由……组成”表示上述培养基中除了含有主要组分NaN03、NaH2PO4 以及微量元素、少量维生素和水外，还可包含一些对于组合物的基本特性或新的特性(即可维持微藻在较短的培养周期内细胞密度达到较高的水平，同时活性物质含量与常规光自养培养相比有较大幅度提高)没有实质上影响的组分。在该培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对微藻细胞密度和品质有很大的实质影响。因此，这些组分的用量不应受实施例的严格限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基中还可加入无机盐，例如硫酸镁、氯化钙和硫酸亚铁等，以及微量元素如 Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co 等。在本发明中，较佳的微量元素组分宜选自FeC6H5O7 ·5Η20，ZnSO4 ·7Η20，MnCl2 ·4Η20， Na2MoO4 · 2H20, CuSO4 · 5Η20, Na2EDTA, CoCl2中的一种或多种或全部。无机盐和微量元素的用量可根据常规知识确定。本发明所采用的改进F/2-Si培养基基本上是由以下成分组成=NaNO3O. 1 1. O 克/升、NaH2PO4 · 2Η20 0. 01 0. 1克/升；微量元素0. 5 鈿1，其中微量元素的组成为 ZnSO4 ·7Η20 0. 02 0. 2 克 / 升，MnCl2 ·4Η20 0. 2 2. 0 克 / 升，CuSO4 ·5Η200· 01 0. 1 克 / 升，FeC6H5O7 · 5Η20 1. 0 10 克 / 升，Na2MoO4 · 2Η20 0. 05 0. 5 克 / 升，Na2EDTA 2. 0 20克/升，CoCl2O. 01 0. 1克/升，维生素0. 5 細1和水，其中微量元素的组成为维生素Β120. 1 1. 0毫克/升，维生素Β150 1000毫克/升，维生素H 0. 1 1. 0毫克/升。在一个较佳的实施方案中，本发明改进的F/2-Si培养基宜由以下成分组成 NaNO3O. 5克/升、NaH2PO4 · 2Η20 0. 05克/升；微量元素1. 5ml，其中微量元素的组成为 ZnSO4 · 7H20 0. 1 0. 15 克 / 升，MnCl2 · 4H201. 0 1. 5 克 / 升，CuSO4 · 5Η20 0. 03 0. 07 克 / 升，FeC6H5O7 · 5H20 3. 0 4. 0 克 / 升，Na2MoO4 · 2Η200· 1 0. 3 克 / 升，Na2EDTA 10 12克/升，CoCl2O. 02 0. 06克/升，维生素2ml和水IOOOmL,其中微量元素的组成为维生素B120. 03 0. 05毫克/升，维生素BllOO 200毫克/升，维生素H 0. 5 1. 0毫克/ 升。在根据上述配方配制培养基后，可用常规手段如酸或碱将所述培养基的pH调为 4.0 9.0。可采用分批培养、补料分批培养、半连续培养(带放)或连续培养等四种方式实施光自养培养。藻细胞采收、油脂的提取及藻体综合利用光自养培养结束后，对微藻进行离心采收，获得湿藻体。藻细胞的采收方法包括但不限于高速离心、絮凝、气浮或过滤等技术；藻细胞破壁方法包括但不限于藻体自溶、高压勻浆、酶水解、水相热解等湿法破壁方法。胞内油脂的提取方法包括但不限于有机溶剂萃取法，即将藻体于80 105°C下干燥至恒重，研磨藻粉后采用氯仿甲醇标准萃取溶剂从干藻粉中提取油脂，萃取溶剂反复提取直至藻粉颜色变为白色，旋转蒸发去除溶剂。上清液中的其他成分可逐步分离提取获得脂肪酸、叶绿素等，或直接将上清液中的所有成分与藻体沉淀混合喷雾干燥获得小球藻粉。本发明中，可对培养所得的微藻进行综合利用，提取其中的色素(例如叶黄素)、蛋白质、多糖等各种活性成分。活性成分的提取顺序并无特殊限制，但通常要满足先提取的步骤不能导致后提取的成分损失这一前提。提取蛋白质、多糖等的方法也是本领域周知的。本文中涉及到藻细胞干重、油脂含量及胞内生化成分的测定方法如下藻细胞干重测定在微藻(如小球藻)培养过程中取培养液V毫升，SOOOrpm离心 10分钟，将离心后的藻体用去离子水洗涤3次，转移至称量瓶(Wl (克))中，在105°C烘箱中烘干至恒重W2(克)。藻体干重Cx可根据下式计算Cx(克/升)=(W2-W1)/V/1000。油脂测定取一定量各培养阶段烘干至恒重的藻细胞，在研钵中研磨至粉末状，称取适量藻粉(0.2 0.5g)小心转移至离心管中，加入适量萃取溶剂(氯仿甲醇=2 1) 于超声振荡器中超声振荡30min，SOOOrpm离心lOmin，将上清转移至已知重量的干燥旋转蒸发瓶中，重复上述步骤直至上清无色。合并上清后旋转蒸干，称重并计算油脂含量。油脂含量(％ )按下式计算油脂(％) = (W2-W0)/W1X100式中W1-为藻粉重量，g ；WO-为烘干至恒重的旋转蒸发瓶重量，g ；W2-为油脂萃取液蒸干后蒸发瓶的重量，go蛋白质含量测定微藻(如小球藻)细胞中总蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法 (宁正祥.食品成分分析手册.北京中国轻工业出版社，1998,76-78)。以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步的说明。除非另有所述，本发明采用的培养基中各组分含量均用克/升(g/L)表示。应理解，本申请中“含有”、“包含”也包括“由……组成”、“由……构成”的含义。实施例1 蛋白核小球藻种子异养及光自养培养过程中藻细胞生长的研究本实施例的蛋白核小球藻分别在500ml的摇瓶中进行异养培养和2L的三角瓶中进行光自养培养。作为下一步光自养培养的种子，分别测定了蛋白核小球藻异养和光自养培养种子的藻细胞生长曲线。蛋白核小球藻种子异养培养时的接种密度为0. 20g/l，温度为 300C，转速为150rmp，培养到7 时，培养液中的葡萄糖已耗完，藻细胞密度为6. 8g/l，用于下一步光自养培养的种子；蛋白核小球藻种子光自养培养时的接种密度为0. 20g/l，温度为25°C，光照强度为20001x，光暗周期为24:0，每天定时摇3次，培养到120h时，藻细胞处于指数生长期，藻细胞密度为0. 56g/l，用于下一步光自养培养的种子(图1)。由此可见， 与光自养培养的种子相比，异养培养的种子细胞密度高(是光自养种子的12. 1倍)并且培养周期短(比光自养种子缩短了 48小时)。实施例2 普通小球藻种子异养及光自养培养过程中藻细胞生长的研究本实施例的普通小球藻分别在500ml的摇瓶中进行异养培养和2L的三角瓶中进行光自养培养，作为下一步光自养培养的种子，分别测定了普通小球藻异养和光自养培养种子的藻细胞生长曲线。普通小球藻种子异养培养时的接种密度为0. 30g/l，温度为30°C， 转速为150rmp，培养到72h时，培养液中的葡萄糖已耗完，藻细胞密度为8. lg/Ι，用于下一步光自养培养的种子；普通小球藻种子光自养培养时的接种密度为0. 30g/l，温度为25°C， 光照强度为20001χ，光暗周期为0，每天定时摇3次，培养到120h时，藻细胞处于指数生长期，藻细胞密度为0.65g/l，用于下一步光自养培养的种子(图幻。由此可见，与光自养培养的种子相比，异养培养的种子细胞密度高(是光自养种子的12. 5倍)并且培养周期短 (比光自养种子缩短了 48小时)。
实施例3 椭圆小球藻种子异养及光自养培养过程中藻细胞生长的研究本实施例的椭圆小球藻分别在500ml的摇瓶中进行异养培养和2L的三角瓶中进行光自养培养，作为下一步光自养培养的种子，分别测定了椭圆小球藻异养和光自养培养种子的藻细胞生长曲线。椭圆小球藻种子异养培养时的接种密度为0. 25g/l，温度为30°C， 转速为150rmp，培养到72h时，培养液中的葡萄糖已耗完，藻细胞密度为8. 8g/l，用于下一步光自养培养的种子；椭圆小球藻种子光自养培养时的接种密度为0. 25g/l，温度为25°C， 光照强度为20001χ，光暗周期为0，每天定时摇3次，培养到120h时，藻细胞处于指数生长期，藻细胞密度为0.71g/l，用于下一步光自养培养的种子(图幻。由此可见，与光自养培养的种子相比，异养培养的种子细胞密度高(是光自养种子的12. 4倍)并且培养周期短 (比光自养种子缩短了 48小时)。实施例4 蛋白核小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的研究本实施例在室内2L圆柱型气升式光生物反应器中光自养培养异养和光自养的蛋白核小球藻种子，分别测定了异养和光自养种子在其光自养过程中的藻细胞生长及油脂产率。异养和光自养种子的接种密度均为0. 3g/l，光自养培养温度均为30°C，均通入2%的 CO2，通气量均为0. 5vvm，光照强度为ΙΟΟΟΟΙχ，光暗周期为对:0。光自养培养到96小时，异养种子的藻细胞密度为2. 03g/l，油脂产率为149. 55mg/l/d ；光自养种子的藻细胞密度仅为0. 93g/l，油脂产率仅为87. 68mg/l/d (图4和图5)。由此可见，与光自养种子相比，异养种子的活力更强，相同培养时间的藻细胞密度更高(是光自养种子的2. 2倍)，油脂产率更高(是光自养种子的1.7倍)。实施例5 普通小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的研究本实施例在室内2L圆柱型气升式光生物反应器中光自养培养异养和光自养的的普通小球藻种子，分别测定了异养和光自养种子在其光自养过程中的藻细胞生长及油脂产率。异养和光自养种子的接种密度均为0. 3g/l，光自养培养温度均为30°C，均通入2%的 CO2，通气量均为0. 5vvm，光照强度为ΙΟΟΟΟΙχ，光暗周期为对:0。光自养培养到96小时，异养种子的藻细胞密度为2. 03g/l，油脂产率为138. 49mg/l/d ；光自养种子的藻细胞密度仅为1. 25g/l，油脂产率仅为82. 81mg/l/d(图6和图7)。由此可见，与光自养种子相比，异养种子的活力更强，相同培养时间的藻细胞密度更高(是光自养种子的1.6倍)，油脂产率更高(是光自养种子的1.7倍)。实施例6 椭圆小球藻异养种子和光自养种子在室内2L光生物反应器中光自养培养的研究本实施例在室内2L圆柱型气升式光生物反应器中光自养培养异养和光自养的的椭圆小球藻种子，分别测定了异养和光自养种子在其光自养过程中的藻细胞生长及油脂产率。异养和光自养种子的接种密度均为0. 3g/l，光自养培养温度均为30°C，均通入2%的 CO2，通气量均为0. 5vvm，光照强度为1ΟΟΟΟΙχ，光暗周期为对:0。光自养培养到96小时，异养种子的藻细胞密度为1.65g/l，油脂产率为121.48mg/l/d;光自养种子的藻细胞密度仅为0. 91g/l，油脂产率仅为72. 29mg/l/d(图8和图9)。由此可见，与光自养种子相比，异养种子的活力更强，相同培养时间的藻细胞密度更高(是光自养种子的1.8倍)，油脂产率更.7倍)。实施例7 蛋白核小球藻异养种子在户外2L光生物反应器中光自养培养的研究本实施例在户外2L圆柱型气升式光生物反应器中光自养培养蛋白核小球藻异养种子，测定了异养种子在其户外光自养过程的藻细胞生长过程及最高油脂产率。初始接种密度为0. 06g/l，温度及光强均为户外实际温度和光强，通气量为0. 3vvm。光自养培养到83 小时，藻细胞密度和油脂产率均达到最高值，分别为1. 44g/l和123. 43mg/l/d(图10)。由此可见，异养的种子不仅在室内可快速地光自养培养并达到高油脂产率，而且在户外仍可以快速地光自养培养并达到高油脂产率。实施例8 蛋白核小球藻异养种子在户外60L塑料盆中光自养培养的研究本实施例在户外60L塑料盆中光自养培养蛋白核小球藻异养种子，测定了异养种子在其户外光自养过程的藻细胞生长过程及最高油脂产率。初始接种密度为0. 10g/l，温度及光强均为户外实际温度和光强，通气量为0. 3vvm。光自养培养到108小时，藻细胞密度和油脂产率均达到最高值，分别为0.75g/l和55.3%ig/l/d(图11)。一个60L塑料盆中的培养体积一般为50L，若要初始接种密度达到0. 10g/l，则需要5g的藻种；用异养培养的种子(见图1)只需4个500ml的摇瓶(装液量为200ml)培养3天即可得到5. 44g的种子， 而用光自养培养的种子(见图1)则需要9个2L的三角瓶(装液量为1L)培养5天才能得到5. 04g的种子。由此可见，与种子光自养培养相比，种子异养培养不仅能缩短种子的培养时间，提高整个培养过程的效率，而且种子培养所需的培养装置用量较少且占地面积较小。 因此，若要户外大规模光自养培养微藻，那么只有采用异养培养种子才能及时满足大量藻种的需求。尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
1权利要求
1.一种微藻培养方法，其特征在于，该方法包括微藻藻种的异养培养步骤和以异养培养所获得的藻细胞作为种子实施的光自养培养步骤。
2.一种油脂生产方法，其特征在于，所述方法包括微藻藻种的异养培养步骤、以异养培养所获得的藻细胞作为种子实施的光自养培养步骤、以及藻细胞采收和油脂提取的步骤。
3.一种蛋白质生产方法，其特征在于，所述方法包括微藻藻种的异养培养步骤、以异养培养所获得的藻细胞作为种子实施的光自养培养步骤、以及藻细胞采收和蛋白质提取的步马聚ο
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，采用分批培养、补料分批培养、 半连续培养和连续培养等模式实施所述微藻藻种的异养培养。
5.如权利要求1-4中任一项所述方法，其特征在于，所述的微藻选自绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)普通小球藻(Chlorella vulgaris), #有圆 zj、 求藻(Chlorella ellipsoidea), Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella saccharophila,Chlorella regularis,Chlorellaminutissima, Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis, 以及绿藻门中的Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonasacidophila, Haematococcus pluvial is, Haematococcus lacustris, ScenedesmusobIiquus, Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，Tetraselmis chuii，Tetraselmis tetrathele， Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ；娃藻 门的 Cylindrotheca fusiformis， Nitzschia laevis， Nitzschia alba, Nitzschiafonticola, Navicula incerta，Navicula pelliculosa ；蓝藻门的 Anabaena variabilis ；金藻门的 Poterioochromonas malhamensis ；甲藻门的 Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii ；裸藻门的 Euglena gricilis ；禾口红藻门的 Galdieria sulphuraria。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述微藻藻种异养培养的步骤包括在生物反应器中加入pH为4. O 9. O的培养基，按工作体积的0. 1 30%接入微藻藻种进行分批培养、补料分批培养、半连续培养或连续培养，培养温度为10 40°C，控制pH 小于9.0，控制溶氧在以上。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，以异养培养所获得的藻细胞作为种子进行光自养培养，包括将异养培养的藻种接到光自养培养装置中进行光自养培养， 培养温度为5 50°C，连续光照或间歇光照，光照强度为0. 1 150klx，光自养培养周期为 5 500小时，初始接种密度为0. 01 10. 00克/升，pH为4. O 12.0。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，藻种的异养培养基由氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水组成；光自养培养基由氮源、无机盐和水组成。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述藻种异养培养步骤在摇瓶、 机械搅拌式、气升式或鼓泡式生物反应器中进行，所述光自养培养步骤在摇瓶或选自敞开式的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱式光生物反应器、薄膜立袋或吊袋等用于微藻光自养培养的装置中进行，光照条件为自然光或人工光。
10.如权利要求1 9中任一项所述的方法，其特征在于，当异养培养液中的有机碳源消耗完后，结束异养培养，并将异养培养所得藻细胞作为种子实施光自养培养步骤。
全文摘要
本发明涉及一种高产率的微藻培养方法，该方法包括微藻藻种的异养培养步骤和以异养培养所获得的藻细胞作为种子的光自养培养步骤。对于可异养生长的微藻，采用本发明方法可充分发挥微藻在异养阶段藻细胞快速生长的优势，不仅能为微藻的大规模光自养培养及时提供大量藻种，而且还可加快微藻光自养生长和目的产物(如油脂、蛋白等)形成速率，为解决微藻大规模光自养培养过程中存在的藻种扩培周期长、细胞生长慢和目的产物产率低的问题，提供了一种重要的技术手段。
文档编号C12R1/89GK102154110SQ20111002915
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者严逸, 李元广, 李淑兰, 梁松涛, 沈国敏, 王伟良, 王军, 章真, 范建华, 陈铖, 韩菲菲, 黄建科 申请人:上海泽元海洋生物技术有限公司, 华东理工大学