一种高含量egcg的提纯方法
【专利摘要】本发明公开了一种高含量EGCG的提纯方法，包括将含有目标成分的液体或浸膏进行结晶的步骤，其中：在结晶步骤中，结晶时的温度控制在4～8℃，整个结晶过程在搅拌条件下进行，搅拌速率为100～300rpm。本发明通过在特定温度下采用100～300rpm的转速进行搅拌结晶的方式，在不需要加入晶种的条件下，使晶体慢慢均匀析出，所得晶体颗粒较粗且颗粒均匀，更容易实现晶体的分离及杂质的去除，且获得的晶体EGCG含量高，晶体的回收率高。
【专利说明】一种高含量EGCG的提纯方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然产物化学【技术领域】，具体涉及一种高含量EGCG的提纯方法。
【背景技术】
[0002]EGCG，即表没食子儿茶素没食子酸酯，是从绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，占绿茶毛重的9%~13% ;EGCG是绿茶茶多酚的主要组成成分，也是绿茶儿茶素类的主要成分，它占绿茶儿茶素类总量的10~15%。因为具有特殊的立体化学结构，EGCG是绿茶中最有效的抗氧化多酚，具有抗氧化、抗癌、抗突变等活性，抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，是维生素E的25倍，能够保护细胞和DNA受损害，这种损害相信与癌症、心脏疾病和其他重大疾病有关，EGCG的这些功效归结于它们对氧自由基的清除(抗氧化)能力。
[0003]现有的对EGCG的提取纯化方法主要有溶剂提取法、离子沉淀法、超临界萃取法、高速逆流层和膜分离技术结合凝胶柱分离制备方法。现有的含有结晶步骤的提纯方法中，在将含有目标成分的液体或浸膏进行结晶时，结晶都在静置条件下进行，但静置结晶的方式不容易析出晶体。采用在静置结晶过程中加入少量高含量EGCG晶体作为晶种的方法，虽然可以达到更快速地结出晶体的目的，但是，在加入晶种后，析出的晶体容易包埋杂质，这在一定程度上会降低晶体中EGCG的含量，特别是当低含量EGCG茶多酚经大孔树脂柱纯化后所得的洗脱液，或者是 由该所得洗脱液经浓缩后得到的浸膏直接进行结晶时，所得晶体中EGCG的含量较低，通常在90%左右，达不到95%的含量要求；另一方面，采用在静置结晶过程中加入晶种的结晶方式所获得的晶体在较细，在分离晶体时容易出现堵塞现象，晶体的洗涤也不便。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种高含量EGCG的提纯方法。该方法通过改变结晶条件，在不需要加入晶种的条件下可以获得高EGCG含量的晶体，且晶体的回收率高。
[0005]本发明所述的高含量EGCG的提纯方法，包括将含有目标成分的液体或浸膏进行结晶的步骤，与现有技术不同的是:在结晶步骤中，结晶时的温度控制在4~8°C，整个结晶过程在搅拌条件下进行，搅拌速率为100~300rpm。通过在特定温度下采用100~300rpm的转速进行搅拌结晶的方式，在不需要加入晶种的条件下，使晶体慢慢均匀析出，晶体较粗且颗粒均匀，更容易实现晶体的分离及杂质的去除，且获得的晶体EGCG含量高，晶体的回收率也高。
[0006]上述技术方案中，当结晶时的温度控制在4~6°C，搅拌速率控制在150~250rpm时，可以使获得的晶体中EGCG的含量及收率更高。
[0007]上述技术方案中，整个结晶过程的时间为10~30h，当整个结晶时间在10~24h范围内时，随着时间的延长，析出的晶体增加明显，当结晶时间超过24h后，析出晶体的增多不明显。[0008]上述技术方案中，所述的含有目标成分的液体或浸膏可以是通过现有常规的对EGCG的提取纯化方法中获得的含有EGCG目标成分的液体或浸膏，但当含有目标成分的液体或浸膏是指由低含量EGCG茶多酚经大孔树脂柱纯化后所得的洗脱液，或者是由该所得洗脱液经浓缩后得到的浸膏时，采用本发明所述方法的效果最为显著，可使获得的晶体EGCG含量达95%以上(HPLC法)；与其它条件相同而采用添加晶种的静置析晶方式相比，晶体的回收率高提高15%以上。这里所指的大孔树脂是指现有技术中用于分离EGCG的常规大孔吸附树脂，通常为大孔吸附树脂的型号可以是0101、0102、0103、即-20、即0-600、48-8、HP20SS、SP20SS、或S-8等。当含有目标成分的液体或浸膏上大孔树脂柱层析后，用于洗脱的溶剂与现有技术相同，通常以20~30%(v/v)乙醇作为洗脱剂，洗脱过程中用薄层层析跟踪检测以收集含目标成分的洗脱液。这里所指的低含量EGCG茶多酚通常是指EGCG含量为5~40wt%的茶多酚，可以直接从市场上购买，也可采用现有常规方法自行制备。当以EGCG含量为10~20wt%的茶多酚为原料时采用本发明所述方法的效果相对来说更显著。
[0009]为了获得更高的收率，上述技术方案优选还包括重结晶步骤，在重结晶步骤中，重结晶的温度控制在4~8°C，整个重结晶过程在搅拌条件下进行，搅拌速率为100~300rpm。这里用于重结晶的溶剂与现有技术相同，通常为20~95%(v/v)的乙醇。重结晶步骤中，重结晶的温度优选控制在4~6°C，搅拌速率优选为150~250rpm。
[0010]本发明所述方法的具体步骤包括:
[0011]I)以低含量EGCG茶多酚为原料，加水溶解；
[0012]2)所得溶解液上大孔树脂柱，先用水洗树脂柱至流出液无色，再用20~30%(v/v)乙醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集醇洗脱液；
[0013]3)将收集的醇洗脱液浓缩至浸膏(40~60%的固形物)，将浸膏送入结晶罐中(也可以将收集的醇洗脱液直接送入结晶罐中进行结晶)，控制结晶罐内温度为4~8°C，开启搅拌，使整个结晶过程在搅拌条件下进行，控制搅拌速率为100~300rpm ；
`[0014]4)将结晶物抽滤，晶体水洗，干燥，即得到高含量EGCG。
[0015]当本发明所述方法还包括重结晶步骤时，只要将上述获得的高含量EGCG用重结晶溶剂溶解，再送入结晶罐中进行重结晶即可，在重结晶过程中，控制结晶罐内温度为4~8°C，使整个重结晶过程在搅拌条件下进行，控制搅拌速率为100~300rpm。
[0016]与现有技术相比，本发明的特点在于:
[0017]1、通过在特定温度下采用100~300rpm的转速进行搅拌结晶的方式，在不需要加入晶种的条件下，使晶体慢慢均匀析出，所得晶体颗粒较粗且颗粒均匀，更容易实现晶体的分离及杂质的去除，且获得的晶体EGCG含量高，晶体的回收率高。
[0018]2、当含有目标成分的液体或浸膏限定为是由低含量EGCG茶多酚经大孔树脂柱纯化后所得的洗脱液，或者是由该所得洗脱液经浓缩后得到的浸膏时，采用本发明所述方法的效果最为显著，可使获得的晶体EGCG达95%以上(HPLUi);与其它条件相同而采用添加晶种的静置析晶方式相比，晶体的回收率高提高15%以上。当在结晶之后再进行重结晶的步骤时，晶体的回收率与其它条件相同而采用添加晶种的静置析晶方式相比可提高20%以上。
【具体实施方式】[0019]下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0020]实施例1
[0021]I)取EGCG含量为10wt%的茶多酚(桂林莱茵生物科技股份有限公司生产)200g置于400ml纯净水中超声溶解30min ；
[0022]2)所得溶解液上DlOl大孔树脂柱，先用水洗树脂柱至流出液无色，再用20%(v/v)乙醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集醇洗脱液；
[0023]3)将收集的醇洗脱液减压浓缩至浸膏(50%的固形物)，将浸膏送入结晶罐中，用冷却循环水降温，控制结晶罐内温度为4°C，开启搅拌进行搅拌结晶24h，使整个结晶过程在搅拌条件下进行，控制搅拌速率为IOOrpm;
[0024]4)将结晶物抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物10.68g。HPLC检测EGCG 含量 95.33%。
[0025]对比例I
[0026]I)取EGCG含量为10wt%的茶多酚(桂林莱茵生物科技股份有限公司生产)200g置于400ml纯净水中超声溶解30min ；
[0027]2)所得溶解液上DlOl大孔树脂柱，先用水洗树脂柱至流出液无色，再用20%(v/v)乙醇洗脱，薄层层析跟踪 检测，收集醇洗脱液；
[0028]3)将收集的醇洗脱液减压浓缩至浸膏(50%的固形物)，将浸膏送入结晶罐中，向结晶罐中加入0.2g的高含量EGCG(98.5%)，促进结晶，用冷却循环水降温，控制结晶罐内温度为4°C，放置24h ；
[0029]4)将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物9.20g。HPLC检测EGCG 含量 90.83%。
[0030]对比例2
[0031]重复对比例1，不同的是，整个结晶过程在常温下进行。
[0032]将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物8.12g。HPLC检测EGCG含量 86.31%。
[0033]对比例3
[0034]重复实施例1,不同的是,结晶过程中搅拌的速率为350rpm。
[0035]将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物8.62g。HPLC检测EGCG含量 91.35%。
[0036]对比例4
[0037]重复实施例1，不同的是，整个结晶过程在2°C进行。
[0038]将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物11.25g。HPLC检测EGCG含量 92.69%ο
[0039]实施例2
[0040]重复实施例1,不同的是,结晶过程中搅拌的速率为200rpm。
[0041]将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物11.38g。HPLC检测EGCG含量 96.53%。
[0042]实施例3
[0043]重复实施例1,不同的是,结晶过程中搅拌的速率为300rpm。[0044]将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物10.24g。HPLC检测EGCG含量 95.87%。
[0045]实施例4
[0046]重复实施例1，不同的是，以EGCG含量为20被％的茶多酚(无锡太阳绿宝科技有限公司生产)100g为原料，结晶过程中结晶罐内的温度为8°C，搅拌结晶的时间为12h，搅拌的速率为200rpm。
[0047]将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物10.21g。HPLC检测EGCG含量 96.11%。
[0048]实施例5
[0049]重复实施例1，不同的是，以EGCG含量为30wt%的茶多酚67g (桂林兴达制药厂生产)，结晶过程中结晶罐内的温度为6°C，搅拌结晶的时间为20h，搅拌的速率为250rpm。
[0050]将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物10.54g。HPLC检测EGCG含量 95.98%ο
[0051]实施例6
[0052]重复实施例1，不同的是，以EGCG含量为40wt%的茶多酚50g (长沙三福生物科技有限公司生产)，结晶过程中结晶罐内的温度为6°C，搅拌结晶的时间为30h，搅拌的速率为150rpmo
[0053]将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物10.66g。HPLC检测EGCG含量 95.96%ο
`[0054]实施例7
[0055]I)、2)、3)步骤同实施例1 ；
[0056]4)将晶体抽滤，用水冲洗，收集晶体再送入结晶罐中，加入晶体重量5倍的20%(v/v)乙醇加热溶解，然后用冷却循环水降温，控制结晶罐内温度为4°C，开启搅拌进行搅拌结晶24h，使整个结晶过程在搅拌条件下进行，控制搅拌速率为IOOrpm ；
[0057]5)将晶体抽滤，用水冲洗，冷冻干燥，得到白色粉末状结晶物8.95g。HPLC检测EGCG 含量 97.80%ο
[0058]由上述各实施例对比例可知，只有当温度控制在4~8°C、搅拌速率为100~300rpm的条件下进行搅拌结晶，才能获得高含量及高收率的晶体。
【权利要求】
1.一种高含量EGCG的提纯方法，包括将含有目标成分的液体或浸膏进行结晶的步骤，其特征在于:在结晶步骤中，结晶时的温度控制在4~8°C，整个结晶过程在搅拌条件下进行，搅拌速率为100~300rpm。
2.根据权利要求1所述的高含量EGCG的提纯方法，其特征在于:所述搅拌速率为150 ~250rpm。
3.根据权利要求1所述的高含量EGCG的提纯方法，其特征在于:所述结晶时的温度控制在4~6°C。
4.根据权利要求1所述的高含量EGCG的提纯方法，其特征在于:整个结晶过程的时间为10~30h。
5.根据权利要求1所述的高含量EGCG的提纯方法，其特征在于:所述的含有目标成分的液体或浸膏是指:由低含量EGCG茶多酚经大孔树脂柱纯化后所得的洗脱液，或者是由该所得洗脱液经浓缩后得到的浸膏。
6.根据权利要求5所述的高含量EGCG的提纯方法，其特征在于:所述的低含量EGCG茶多酚是指EGCG含量为5~40wt%的茶多酚。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的高含量EGCG的提纯方法，其特征在于:还包括重结晶步骤，在重结晶步骤中，重结晶的温度控制在4~8°C，整个重结晶过程在搅拌条件下进行，搅拌速率为100~300rpm。
8.根据权利要求7所述的高含量EGCG的提纯方法，其特征在于:所述搅拌速率为150 ~250rpm。
9.根据权利要求7所述的高含量EGCG的提纯方法，其特征在于:所述重结晶的温度控制在4~6°C。
【文档编号】C07D311/62GK103613575SQ201310626320
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】宋云飞, 梁远盛, 李元元, 李 杰, 蒋治舟 申请人:桂林莱茵生物科技股份有限公司