专利名称：检测水稻植株早衰的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，尤其涉及一种检测水稻早衰基因的分 子标记方法。
背景技术：
叶片衰老，作为叶片发育的最终阶段，被认为是程序性细胞死亡的一种，以依赖年 龄的方式进行，由诸多环境因素诱导。受生长发育时期内外因素复杂相互作用的影响，内部 因素包括发育阶段和激素水平等，外部因素包括温度、干旱、营养缺失、黑暗、创伤和病原体 感染等。一些有关植物生长和发育关键基因的缺失将诱导自发性细胞死亡，并显示出类似 于病原菌诱导的细胞死亡的过敏性反应。现有如何检测水稻是否存在早衰基因还未见有公 开文献报道过。
发明内容
为了快速有效地检测水稻是否存在早衰基因，本发明的目的在于提供一种检测水 稻植株早衰的分子标记方法，该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点。为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案检测水稻植株早衰的分子标记方法，该方法包括水稻植株DNA提取，将提取的DNA 模板和特异性分子标记PCR扩增，对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型；所 述的特异性分子标记选自以下特异性分子标记中的一条或两条结合使用I、检测水稻早衰显性基因的特异性分子标记sgl，上游端自5'端至3'端的核苷 酸序列为ATGGAGGTAGTTTCTGCG (如SEQ ID NO 1所示)，下游端自5 ‘端至3 ‘端的核苷酸 序列为 CGTTGGGCTACAGGAAGA(如 SEQ ID NO 2 所示)；II、检测水稻早衰隐性基因的特异性分子标记sg2，上游端自5'端至3'端的核 苷酸序列为ATAACTGAGAAATAAGGGTC (如SEQ ID NO 3所示)，下游端自5 ‘端至3 ‘端的核 苷酸序列为 CTGTTTAAGAATCCACGAT (如 SEQ ID NO 4 所示)；上述的特异性分子标记sgl检测显性基因A的存在与否，特异性分子标记sg2检 测隐性基因a的存在与否，两者结合使用可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。作为一种水稻植株DNA提取的方法，本发明的水稻植株DNA提取的方法可以如 下①取4 6cm2的水稻叶片于含有400 μ ITPS的1. 5ml离心管中，用Iml的枪头将 叶片稍微捣碎并压到管底，75°C水浴30min ；②水浴后 12000rpm，离心 IOmin ；③取400 μ 1上清液于离心管中，加入等体积的异丙醇，12000rpm离心IOmin ；④弃上清液，取沉淀，加入lml70%的乙醇洗涤，12000rpm离心5min ；⑤弃上清液，取沉淀，室温干燥10 20min，加入30 50μ 11/10TE溶解；⑥PCR反应时20 μ 1反应体系取1 μ 1，提好的DNA做DNA模板，TPS溶液组成如下IOOmMTris-HCl, pH 为 8. 0，1 OmMEDTA，pH 为 8. 0，IMKCl。作为优选，上述的PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行，其中①PCR反应体系20 μ 1如下DNA 模板 1 μ 1，dNTPs,2mM,2y 1,Buffer，含 Mg2+，10X，2y 1，特异性分子标记Sgl或特异性分子标记sg2，正向引物，10 μ M，0. 5 μ 1，特异性分子标记Sgl或特异性分子标记sg2，反向引物，10 μ Μ，0. 5 μ 1，Taq 酶，2υ/μ 1，0· 5μ 1，Η2013. 5μ 1 ；②PCR反应条件(1)特异性分子标记sgl温度反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30sec， 55°C退火30sec，72°C延伸30sec，共36个循环；最后72°C延伸lOmin。(2)特异性分子标记sg2温度反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30sec， 57°C退火30sec，72°C延伸90sec，共36个循环；最后72°C延伸lOmin。作为优选，上述对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型的方法如 下将扩增产物，经溴化乙锭染色后上样在琼脂糖凝胶上，电泳，在UVP凝胶成像仪上成 像；根据特异性分子标记Sgl和Sg2有无条带，检测显性基因A和隐性基因a的存在与否。本发明设计特异性分子标记sgl和sg2，对水稻苗期提取的DNA进行PCR扩增后， 根据其PCR产物，检测水稻植株早衰性状的基因型，该方法具有检测准确性高，操作简单， 成本低廉的特点。
图1为特异性分子标记sgl对 体的PCR扩增结果。图2为特异性分子标记sg2对 体的PCR扩增结果。图3为特异性分子标记sgl对 群体的PCR扩增结果。图4为本发明的特异性分子标记sg2对“日本晴/浙粳早衰”杂交后没有早衰性 状分离的群体的PCR扩增结果。图中，M代表标记(Marker)，N代表日本晴(Nipponbare)； S代表浙粳早衰A代表“日本晴/浙粳早衰”的杂种F1植株；F2代表“日本晴/浙粳早衰” 的杂种F2植株。
具体实施例方式发明人将浙粳早衰与籼稻品种9311 (国家水稻中期库保存号CN20483)和粳稻品 种日本晴(国家水稻中期库保存号CN5590)分别配组，构建群体，分析各个株系的基因型。 浙粳早衰(已提交保藏)，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2010年1
“日本晴/浙粳早衰”杂交后有早衰性状分离的群 “日本晴/浙粳早衰”杂交后有早衰性状分离的群 “日本晴/浙粳早衰”杂交后没有早衰性状分离的月27日，保藏编号CGMCCNo. 3597，分类命名水稻Oryza sativa，性状稳定。种植上述日本晴与浙粳早衰杂交后的F2群体，苗期采用特异性分子标记Sgl 和sg2分别进行水稻植株早衰基因的检测。特异性分子标记sgl的上游端自5'端至 3'端的核苷酸序列为ATGGAGGTAGTTTCTGCG，下游端自5'端至3'端的核苷酸序列为 CGTTGGGCTACAGGAAGA ；特异性分子标记sg2的上游端自5'端至3'端的核苷酸序列为 ATAACTGAGAAATAAGGGTC，下游端自 5'端至 3'端的核苷酸序列为 CTGTTTAAGAATCCACGAT。一、水稻植株DNA提取1.取4-6cm2的水稻叶片于含有400 μ 1 TPS的1. 5ml离心管中，用Iml的枪头将 叶片稍微捣碎并压到管底，75°C水浴30min。2. 12000rpm，离心 lOmin。3.取400 μ 1上清液于离心管中，加入等体积的异丙醇，12000rpm离心lOmin。4.弃上清液，取沉淀，加入Iml 70%的乙醇洗涤，12000rpm离心5min。5.弃上清液，取沉淀，室温干燥10-20min，加入30-50 μ 1 1/10ΤΕ溶解。6. PCR反应时20 μ 1反应体系取1 μ 1提好的DNA做模板。TPS 溶液组成IOOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，IOmM EDTA (ρΗ8· 0)，IM KCl。二、PCR 扩增PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。1. PCR反应体系(20 μ 1)如下DNA 模板 1 μ 1dNTPs (2mM) 2 μ 1Buffer (含 Mg2+，10 X) 2 μ 1sgl (或 sg2)(正向引物，10μΜ)0·5μ 1sgl (或 sg2)(反向引物，10 μ Μ) 0.5 μ 1Taq 酶(鼎国公司，2υ/μ 1)0. 5μ 1H2O 13. 5μ 12. PCR反应条件(1)引物sgl温度反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30seC，55°C退火 30sec，72°C延伸30sec，共36个循环；最后72°C延伸lOmin, PCR产物大小298bp。(2)引物sg2温度反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30seC，57°C退火 30sec，72°C延伸90sec，共36个循环；最后72°C延伸lOmin, PCR产物大小1448bp。三、PCR反应产物检测将扩增产物，经溴化乙锭染色后上样在1 %琼脂糖凝胶上，电泳，在UVP凝胶成像 仪上成像。从正常表型植株中收获的种子，有两种基因型。一种是显性纯合的正常表型植株 (AA基因型)，后代不发生分离，都出现正常表型；另一种是杂合的植株(Aa基因型)，虽然 当代表现为正常表型，但后代发生分离，出现正常和早衰两种表型。分别对这两种群体进行 检测，标记sgl检测显性基因(A)的存在与否，标记sg2检测隐性基因(a)的存在与否，两 者结合使用可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。如图1和2所示，在有分离的群体中， 泳道1，4，7，11和12，用sgl检测有条带，说明存在显性基因A ;sg2检测无条带，说明不存在隐性基因a，这些植株的基因型为AA。泳道2，5，9，10，13和14，用sgl检测有条带，说明存 在显性基因A ；sg2检测也有条带，说明存在隐性基因a，这些植株的基因型为Aa。泳道3，6 和8，用sgl检测无条带，说明不存在显性基因A ；用sg2检测有条带，说明存在隐性基因a， 说明这些植株的基因型为aa。如图3和4所示，在没有分离的群体中用sgl检测所有植株 均有条带，说明存在显性基因A ；sg2检测均无条带，说明不存在隐性基因a，由此推测所有 植株的基因型均为AA，与实际相符。这说明，利用分子标记sgl和sg2能够准确检测早衰植 株的基因型。
权利要求
检测水稻植株早衰的分子标记方法，其特征在于该方法包括水稻植株DNA提取，将提取的DNA模板和特异性分子标记PCR扩增，对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型的步骤；所述的特异性分子标记选自以下特异性分子标记中的一条或两条结合使用I、检测水稻早衰显性基因的特异性分子标记sg1，上游端自5′端至3′端的核苷酸序列为ATGGAGGTAGTTTCTGCG，下游端自5′端至3′端的核苷酸序列CGTTGGGCTACAGGAAGA；II、检测水稻早衰隐性基因的特异性分子标记sg2，上游端自5′端至3′端的核苷酸序列为ATAACTGAGAAATAAGGGTC，下游端自5′端至3′端的核苷酸序列为CTGTTTAAGAATCCACGAT；上述的特异性分子标记sg1检测显性基因A的存在与否，特异性分子标记sg2检测隐性基因a的存在与否，两者结合使用可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。
2.根据权利要求1所述的检测水稻植株早衰的分子标记方法，其特征在于水稻植株 DNA提取的方法如下①取4 6cm2的水稻叶片于含有400μ ITPS的1. 5ml离心管中，用Iml的枪头将叶片 稍微捣碎并压到管底，75°C水浴30min ；②水浴后12000rpm，离心IOmin；③取400μ 1上清液于离心管中，加入等体积的异丙醇，12000rpm离心IOmin ；④弃上清液，取沉淀，加入lml70%的乙醇洗涤，12000rpm离心5min；⑤弃上清液，取沉淀，室温干燥10 20min，加入30 50μ11/10TE溶解；⑥PCR反应时20μ 1反应体系取1 μ 1，提好的DNA做DNA模板，TPS溶液组成如下 IOOmMTris-HCl, pH 为 8. 0，1 OmMEDTA，pH 为 8. 0，IMKCl。
3.根据权利要求1所述的检测水稻植株早衰的分子标记方法，其特征在于PCR扩增反 应在PCR扩增仪上进行，其中①PCR反应体系20μ 1如下 DNA 模板 1 μ 1， dNTPs,2mM,2y 1，Buffer，含 Mg2+，IOX，2 μ 1，特异性分子标记sgl或特异性分子标记sg2，正向引物，10 μ Μ，0. 5 μ 1， 特异性分子标记sgl或特异性分子标记sg2，反向引物，10 μ Μ，0. 5 μ 1， Taq 酶，2υ/μ 1,0. 5μ 1， Η2013· 5μ 1 ；②PCR反应条件(1)特异性分子标记sgl温度反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30seC，55°C退 火30sec，72°C延伸30sec，共36个循环；最后72°C延伸lOmin。(2)特异性分子标记sg2温度反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30seC，57°C退 火30sec，72°C延伸90sec，共36个循环；最后72°C延伸lOmin。
4.根据权利要求1所述的检测水稻植株早衰的分子标记方法，其特征在于对PCR反应 产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型的方法如下将扩增产物，经溴化乙锭染色后上 样在1 %琼脂糖凝胶上，电泳，在UVP凝胶成像仪上成像；根据特异性分子标记sgl和sg2有无条带，检测显性基因A和隐性基因a的存在与否。
全文摘要
本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，尤其涉及一种检测水稻早衰基因的分子标记方法。检测水稻植株早衰的分子标记方法，该方法包括水稻植株DNA提取，将提取的DNA模板和特异性分子标记PCR扩增，对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型；所述的特异性分子标记选自以下一条或两条结合使用I、sg1，上游端如SEQ ID NO1所示，下游端如SEQ ID NO2所示；II、sg2，上游端如SEQ ID NO3所示，下游端如SEQ ID NO4所示；两者结合使用可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。本发明设计特异性分子标记sg1和sg2，对水稻苗期提取的DNA进行PCR扩增后，根据其PCR产物，检测水稻植株早衰性状的基因型，该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点。
文档编号C12Q1/68GK101935695SQ201010134159
公开日2011年1月5日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者严雯奕, 何祖华, 叶胜海, 张小明, 董彦君, 金庆生 申请人:浙江省农业科学院;中国科学院上海生命科学研究院