分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，尤其涉及一种分子标记法检测水稻温敏雄性不育基因的方法及其分子标记。
【背景技术】
[0002]水稻温敏雄性不育系为利用两系法实现水稻杂种优势利用的重要种质资源，其在高温长日照条件下表现为雄性不育，可用于生产杂交种子；而在低温短日照条件下又表现为雄性可育，可用于自交繁殖。相对于三系杂交稻而言，两系杂交水稻以生产程序简化、杂交配组自由、能够克服三系不育细胞质负效应和容易实现籼粳亚种间杂种优势利用等特点而得到广泛利用。水稻基因调控温敏雄性不育系衡农S-1的温敏雄性不育性状，
基因被鉴定为其候选基因。在衡农S-1温敏雄性不育系中基因内部发生一个从T到C的单碱基突变，利用该碱基突变结合PCR和限制性内切酶的酶切技术可以发展出一种新的dCAPS分子标记，该标记与温敏雄性不育基因完全连锁，可用于tms9-藤因的检测、基因的分子标记辅助选择和转育等用途。
【发明内容】
[0003]为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种分子标记法检测水稻温敏雄性不育基因的方法，本发明的第二个目的是提供上述的方法采用的分子标记。本发明的检测方法准确性好、操作简单、成本低廉、实用性强。
[0004]为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
分子标记法检测水稻温敏雄性不育基因的方法，该方法包括以下的步骤:
1)提取待测样品的DNA，采用分子标记QY-1进行PCR扩增，分子标记QY-1的引物对为:QY-1Fdr -GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3' ;QY_1R:5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3' ;PCR扩增条件为 95°C预变性 3min、95°C变性 30 sec、55°C退火 30 sec、72°C延伸 30sec，共35个循环，最后72°C延伸5 min ；
2)PCR反应产物用于Smal酶切反应，酶切方法为:PCR反应产物10μ 1、Smal限制性内切酶 0.5 μ 1，浓度为 I U/μ l、10XFastDigest buffer 2 μ 1，去离子水 7.5 μ 1，酶切反应在30°C水浴锅中温浴20 min，加入4μ1 6 X loading buffer后于3%琼脂糖凝胶120U电压电泳30 min，在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照；
3)待测DNA样品经过PCR扩增和Smal酶切后，电泳方式能检测出259bp片段的含基因的水稻材料，而片段大小为286bp的则是无基因的水稻材料。
[0005]作为优选，所述的待测样品的DNA的提取方法如下:
1)取2cm长的水稻叶片放入2 ml离心管中，加入液氮后将水稻叶片磨碎，再加入500μ I 2%的CTAB提取液，CTAB: 2 g，放于75°C水浴30 min ；100 ml CTAB提取液包括以下的组分:1 mol/L Tris-Hcl ρΗ8.0 10 ml; 0.5 mol/L EDTA pH8.0 4 ml; Nacl: 8.12 g ；
2)加入等体积氯仿/异戊醇充分振荡后，氯仿/异戊醇的体积比为24:1，放入离心机中12，OOO rpm离心10 min，静止5 min后吸取500 μ I上清液于1.5 ml离心管；
3)加入等体积预冷的异丙醇后上下混匀，放入离心机中12,000rpm离心10 min ；
4)弃上清液并加入500μ I 70%的乙醇进行洗涤；12，000 rpm离心5min弃上清液后可见DNA的白色沉淀；
5)室温干燥10-20min后，加入500 μ I去离子水溶解。
[0006]为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种与水稻温敏雄性不育基因完全连锁的dCAPS分子标记QY-1，该分子标记的引物对为:QY-1F:5' -GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3' ;QY_1R:5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3r 。
[0007]本发明由于采用了上述的技术方案，特异性分子标记QY-1是以温敏雄性不育tms9~m因的候选基因《5#分的单碱基突变为基础，经过PCR扩增并结合Smal酶切特点的dCAPS分子标记，其与基因完全连锁，特异性高，可用于基因的检测，tms9-l基因的分子标记辅助选择和转育等，该检测方法准确性好、操作简单、成本低廉、实用性强。
【附图说明】
[0008]图1为QY-1标记在？2群体中的雄性不育单株、衡农S-1和明恢63中的检测结果；图1中M为分子量标准，匕为F 2群体中雄性不育单株样品，P工为衡农S-1, P 2为明恢63。
【具体实施方式】
[0009]种植上述衡农S-1与明恢63杂交后的F2群体，在杭州正季于水稻抽穗期选取雄性不育单株的叶片，采用特异性dCAPS分子标记QY-1对細59-2基因进行检测。特异性分子标记QY-1F的核苷酸序列为5丨-GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3丨，QY-1R的核苷酸序列为5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3'，PCR 产物大小 286bp，PCR 扩增后每个样品吸取 10μ I的DNA用于Smal酶切反应，酶切后经3%琼脂糖凝胶120 U电压电泳检测，含有tms9_l基因的DNA片段大小为259bp，而不含基因的DNA片段大小为286bp。
[0010]一、DNA 提取
1.取2 cm长的水稻叶片放入2 ml离心管中，加入液氮后将水稻叶片磨碎，再加入500μ I 2% 的 CTAB 提取液(100 ml CTAB 提取液:1 mol/L Tris-Hcl ρΗ8.0 10 ml; 0.5 mol/L EDTA pH8.0 4 ml; Nacl: 8.12 g; CTAB: 2 g)放于 75°C 水浴 30 min。
[0011]2.加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)充分振荡后，放入离心机中12,000 rpm离心10 min，静止5 min后吸取500 μ I上清液于1.5 ml离心管。
[0012]3.加入等体积预冷的异丙醇后上下混匀，放入离心机中12，000 rpm离心10 min。
[0013]4.弃上清液并加入500 μ I 70 %的乙醇进行洗涤；12，000 rpm离心5min弃上清液后可见DNA的白色沉淀。
[0014]5.室温干燥10-20 min后，加入500 μ I去离子水溶解。
[0015]6.DNA溶液保存在-20°C冰箱中，每个样品取2 μ I用于PCR反应。
[0016]二、PCR 扩增
PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
[0017]1.PCR反应体系 20 μ I反应体系(20 μ I):
去离子水(ddH20)12.7 μ I
10XPCR buffer2 μ I
dNTP 混合物(2mM)2 μ I
Primer-F (10 μ Μ)0.5 μ I
Primer-R (10 μ Μ)0.5 μ I
Taq enzyme (2 U/μ I)0.3 μ I
模板 DNA (20 ng)2 μ?
2.PCR反应条件:
标记QY-1的PCR反应条件为:95°C预变性3 min，95°C变性30 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸30 sec，共35个循环；最后72°C延伸5 min。
[0018]3.酶切反应体系(20 μ I):
20 μ I反应体系:
PCR反应产物10 μ I
Restrict1n enzyme (I U/μ I) 0.5 μ I1XFastDigest buffer2 μ I
去尚子水(ddH20)7.5 μ I
4.酶切反应条件:
酶切反应在恒温水浴锅内进行，根据Smal限制性内切酶的活性温度(30°C)，将反应体系混合物置于水浴锅中30°C温浴20 min，加入4 μ I 6X loading buffer后进行电泳检测，Smal限制性内切酶及反应缓冲液购自MBI Fermentas公司。
[0019]三、PCR反应产物检测
将酶切产物在加入EB (溴化乙锭)的3%琼脂糖凝胶上电泳，120 U电压电泳30 min,在Tanon 2500凝胶成像仪进行拍照并保存。
[0020]水稻温敏雄性不育基因在衡农S-1温敏雄性不育系中其候选基因OsMSl发生一个从C到T的单碱基突变，而在明恢63等常规品种中flsU/基因的DNA序列正常，并未发生相应的突变。因此，利用这个单碱基突变设计特异的引物，对其突变位点和相邻的DNA区段进行PCR扩增，由于衡农S-1中flsU/基因发生了一个单碱基突变，因此，用特异引物扩增的PCR片段可被Smal酶切，而明恢63等常规水稻品种中未发生相应的碱基突变，因此，其PCR扩增片段不能被Smal酶切，而F2群体中的雄性不育单株含有纯合的tms9-.因，其扩增片段也能被Smal酶切，条带大小与衡农S-1相同。如图1所示，在F2群体中，雄性不育单株的条带与衡农S-1的条带完全一致，大小为259bp ;而明恢63由于基因未发生单碱基突变，PCR产物不能被Smal酶切，因此，其电泳条带为286bp。
【主权项】
1.分子标记法检测水稻温敏雄性不育基因的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: 1)提取待测样品的DNA，采用分子标记QY-1进行PCR扩增，分子标记QY-1的引物对为:QY-1Fdr -GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3' ;QY_1R:5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3' ;PCR扩增条件为 95°C预变性 3min、95°C变性 30 sec、60°C退火 30 sec、72°C延伸 30sec，共35个循环，最后72°C延伸5 min ； 2)PCR反应产物用于Smal酶切反应，酶切方法为:PCR反应产物10μ 1、Smal限制性内切酶 0.5 μ 1，浓度为 I U/μ l、10XFastDigest buffer 2 μ 1，去离子水 7.5 μ 1，酶切反应在30°C水浴锅中温浴20 min，加入4μ1 6 X loading buffer后于3%琼脂糖凝胶120U电压电泳30 min，在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照； 3)待测DNA样品经过PCR扩增和Smal酶切后，电泳方式能检测出259bp片段的含 基因的水稻材料，而片段大小为286bp的则是无基因的水稻材料。
2.根据权利要求1所述的分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-l基因的方法，其特征在于待测样品的DNA的提取方法如下: 1)取2cm长的水稻叶片放入2 ml离心管中，加入液氮后将水稻叶片磨碎，再加入500μ I 2%的CTAB提取液，CTAB: 2 g，放于75°C水浴30 min ；100 ml CTAB提取液包括以下的组分:1 mol/L Tris-Hcl ρΗ8.0 10 ml; 0.5 mol/L EDTA pH8.0 4 ml; Nacl: 8.12 g ； 2)加入等体积氯仿/异戊醇充分振荡后，氯仿/异戊醇的体积比为24:1，放入离心机中12，000 rpm离心10 min，静止5 min后吸取500 μ I上清液于1.5 ml离心管； 3)加入等体积预冷的异丙醇后上下混匀，放入离心机中12,000rpm离心10 min ； 4)弃上清液并加入500μ I 70%的乙醇进行洗涤；12，000 rpm离心5min弃上清液后可见DNA的白色沉淀； 5)室温干燥10-20min后，加入500 μ I去离子水溶解。
3.一种与水稻温敏雄性不育基因完全连锁的dCAPS分子标记QY-1，其特征在于，该分子标记的引物对为:QY-1F:5' -GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3' ;QY_1R:5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3'。
【专利摘要】本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，尤其涉及一种分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法及其分子标记。该方法包括：特异性dCAPS分子标记QY-1，其上游引物QY-1F的核苷酸序列为5′-GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3′，下游引物QY-1R的核苷酸序列为5′-CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3′；PCR后产物进一步内切酶Sma1酶切，经3%琼脂糖凝胶120 U电压电泳30min后仅检测到大片段，待测DNA样品经过PCR扩增和Sma1酶切后，电泳方式能检测出259bp片段的含tms9-1基因的水稻材料，而片段大小为286bp的则是无tms9-1基因的水稻材料。该方法检测特异性好、准确性高、操作简便、成本低廉、实用性强。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104818332
【申请号】CN201510227349
【发明人】祁永斌, 金庆生, 刘庆龙
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月6日