专利名称：灌注-灌流-脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器的制作方法
技术领域：
本发明属于组织工程和生物制造领域，涉及一种灌注-灌流-脉动联合构建的组 织工程心肌生物反应器，同时实现组织工程心肌体外培养过程中细胞种植阶段的细胞灌 注、组织培养阶段的灌流培养及脉动训练，模拟体内环境，其主要运行参数可以自动调节和 控制。
背景技术：
心脏是人体血液循环的动力器官，是维持人体生命活动的重要器官。目前，各种心 脏疾病成为人类健康最可怕的杀手。目前诸多临床治疗手段都存在一定的局限性。心肌 组织工程是组织工程领域的研究热点，它的基本原理是在体外构建细胞和材料的三维结构 体，并进行适当的力、电、离子等物理化学刺激，试图培养出具有初步组织功能的心肌组织 替代物，或者用于药物筛选和疾病研究等。由于心肌细胞为终末细胞，不具备增殖分化能力，心肌组织对缺氧敏感，一旦坏死 就不可再生，组织工程心肌的体外构建具有特殊的难度。国内外十几年间关于心肌组织工 程展开了一系列研究，得到了一些重要的成果，但也遇到了以下问题(一 )心肌细胞无法自增殖的特点，使得在组织工程支架上种植心肌细胞时，需要 高的密度及细胞长入的深度，但传统办法，细胞很难进入支架内部，只能将细胞种植在支架 表面一定厚度内。(二)由于细心细胞对缺氧敏感，细胞容易在培养过程中缺血凋亡，并随着细胞距 离支架表面深度的增加，凋亡几率越大。研究发现，心肌细胞在组织工程支架中存活的厚度 最多不超过200 μ m,这与真实的心肌组织有很大差距。(三)组织工程心肌在体外培养过程中缺乏类似真实体内的环境，心肌细胞难以 建立连接，铺展形成组织。在真实体内环境中，心肌自主跳动，对心肌细胞具有周期性应力 作用。目前组织工程心肌研究界普遍认为(Ali Khademhosseini, Joseph P. Vacanti and Robert Langer. Progress In Tissue Engineering. Scientific American, May 2009 64-71)，一定的应力环境中，心肌细胞可以沿主应力方向伸展、互相连接、形成心肌纤维束。文献(王常勇.心脏再生与心肌组织工程研究进展.解剖学杂志，2008年第31卷 第1期.)研究发现，体外构建模拟体内真实环境的生物反应器，在提高细胞种植密度、促进 氧气循环、模拟细胞生存真实环境等方面具有显著效果。目前在组织工程中普遍使用的生物反应器包括搅拌式反应器、旋转培养式反应 器、灌流式反应器、应力刺激式反应器和空心纤维式反应器。前四种反应器都见到有应用于 工程化心肌组织体外培养的报道。其中以灌流式反应器和应力刺激式反应器报道最多，取 得效果也最好。灌流式反应器在工作时，全部培养液将缓慢通过三维支架材料，培养组织周边 与中心同时进行直接的营养交换，三维支架内部的氧分压水平较好。同时灌流过程中的 液体微量循环流动有利于种子细胞均勻分布，并可能导致心肌细胞进入支架较深层的位置。灌流式生物反应器被广泛应用于心肌组织培养。多伦多大学和哥伦比亚大学的 Radisic 等人(Milica Radisic, AnnaMarsano, Robert Maidhof, Yadong Wang, Gordana Vunjak-Novakovic. Cardiac tissueengineering using perfusion bioreactor systems. Nature Protocols, Vol. 3，No. 4,2008 :719_738)设计了一种灌流生物反应器，在实验中实 现了对组织工程心肌的灌流，证明了灌流提高了组织工程支架中的氧分压和营养物质的循 环，提高了组织工程深度方向上细胞的存活率。同时，一些科学家在培养液灌流基础上，进 一步提出了在细胞种植阶段进行细胞灌注的概念，试图提高细胞的种植深度，并正在展开 相关研究。灌流式生物反应器在心肌组织培养中可能存在的问题是液体流动给细胞造成 的剪应力可能对细胞造成一定的伤害。应力刺激式反应器在工作时，通过一定的机械结构对种植有心肌细胞的组织工 程支架做具有周期规律的拉伸运动。心肌细胞受到应力刺激，促使心肌细胞沿一定的 方向进行定向伸展和排列。德国学者Zimmermann等人(Thomas Eschenhagen, Wolfram H. Zimmermann. Engineering Myocardial Tissue. Circulation Research 2005 ；97 1220-1231.)和中国清华大学张婷等人(张婷，熊卓，颜永年，张人佶，潘际銮，马超.组织工 程心肌片层的体外二维力学训练及仿真.机械工程学报2009，45 (7) =38-42.)通过不同形 式的应力刺激生物反应器，培养出来了环状或者片状的，具有自主跳动能力的心肌组织。但 现有报道中，应力刺激生物反应器在施加训练时，无法对组织工程心肌提供灌流等环境，培 养环境无法达到最佳，反应器结构也较为复杂。同时，目前应力刺激生物反应器所能施加的 应力效果通常比较单一，并容易造成应力不均勻。通过对不同生物反应器的调查研究，可以发现生物反应器提供的细胞灌注效果， 可以提高心肌细胞在组织工程支架中的种植深度；生物反应器提供的灌流效果，可以提高 支架内部的氧分压和营养物质的循环，提高活细胞层的厚度；生物反应器提供的应力训练 效果，可以促进心肌细胞的伸展和连接，形成连贯的具有自主跳动能力的心肌纤维束。现有的报道和发明专利中，分别有关于细胞灌注、灌流和脉动的相关生物反应器 的报道，但由于其相互间机构设计有较大的矛盾与冲突、相互间作用关系不明确等，尚没有 可以实现多因素联合培养的生物反应器，其主要原因是细胞灌注、灌流培养和应力训练的 作用环境不同、机理不同，在生物反应器结构上，无法很好的解决结构设计问题以保证各自 效果均正常实现，容易导致反应器结构复杂、无法进行维护和反复使用、各功能运行参数无 法匹配等问题。
发明内容
本发明的目的是设计制造一种灌注-灌流-脉动联合构建的组织工程心肌生物反 应器，用于在体外构建组织工程心肌，实现培养大厚度具有自主跳动能力的组织工程心肌。本发明的技术方案如下一种灌注-灌流-脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，其特征在于所述的 反应器包括细胞灌注发生器、灌流模块、脉动发生器、培养模块和控制模块；所述的灌流模 块包括培养液储液瓶和蠕动泵，培养液储液瓶和蠕动泵之间通过装有流速计的第二灌流管 道连接，在所述的培养液储液瓶顶部装有空气过滤器；所述的培养模块包括脉动腔、脉动效 应软管和灌流腔，脉动腔和脉动效应软管位于灌流腔内，脉动腔下部与脉动效应软软管的上端连接，脉动效应软管的下端封闭；脉动腔上部通过装有压力表的脉动管道与脉动发生 器连接；所述的灌流腔上部装有细胞悬液注入阀门，该灌流腔通过第一灌流管道与培养液 储液瓶连通，在灌流腔下部设有三通阀，该三通阀的一个出口与灌流腔连通，另外两个出口 分别通过第二灌流管道和灌注管道与蠕动泵和细胞灌注发生器连接；所述的细胞灌注发生 器、蠕动泵和脉动发生器均通过控制线路与控制模块连接。上述技术方案中，所述的培养模块，脉动腔和灌流腔均为圆桶状，各自密闭；培养 模块的采用具有生物相容性的材料。所述的第一灌流管道、第二灌流管道和灌注管道采用 具有生物相容性的管道。所述的脉动效应软管采用具有弹性和生物相容性的材料制作。本发明所述的脉动发生器由活塞和活塞缸组成，活塞缸中充满液体或气体介质。 所述的细胞灌注发生器由活塞和活塞缸组成，活塞缸中充满气体介质。本发明的另一技术特征是在所述的流速计、蠕动泵、脉动发生器和细胞灌注发生 器上均设有传感器，所述的传感器通过控制线路与所述的控制模块连接。本发明提供的生物反应器在组织工程心肌体外构建中，和已有技术相比具有以下 优点及突出性效果第一、通过细胞灌注发生器进行细胞悬液的灌注，可以将心肌细胞种植到支架的 深层位置，提高支架上的细胞种植密度。第二、通过灌流模块可以有效加强种植有心肌细胞的支架内部的营养物质和氧气 的交换，提高支架内部心肌细胞的存活率。第三、通过脉动发生器使得脉动效应软管进行周期性脉动，可以对心肌组织施以 应力刺激，有效促进心肌细胞的伸展和定向连接。第四，细胞灌注、灌流模和脉动相关机构在培养模块处通过灌流腔和脉动腔的设 计有机结合，可以使细胞种植、培养过程中应力刺激和体液循环环境分步骤或同时施加在 一套装置中实现，攻克了设计中由于结构复杂难以联合的问题。第五、培养模块与灌注、灌流、脉动相关机构的驱动装置分离，中间通过管道连接， 既保证组织工程心肌可以在CO2培养箱的环境中培养，也降低了其它驱动装置在设计选材中 对于耐高温高压灭菌和耐湿热环境的要求，降低了生物反应器的制造成本、简化了维护环节。第六、设计了控制模块，通过程序可以读取传感器的信号，控制各个驱动装置，对 细胞灌注、灌流培养、脉动训练进行自动可编程控制，适应不同构建要求。
图1为本发明所述的灌注_灌流_脉动联合构建的生物反应器的原理结构简图。图2为本发明所述的灌注_灌流_脉动联合构建的生物反应器结构组成示意图。其中1.控制模块；2.灌流模块；3.培养模块；4.三通阀；5.脉动发生器；6.脉 动腔；7.灌流腔；8.细胞灌注发生器；9a.第一灌流管道；9b.第二灌流管道；10.空气过滤 器；11.培养液储液瓶；12.流速计；13.传感器；14.蠕动泵；15.脉动效应软管；16.脉动管 道；17.细胞悬液注入阀门；18.控制连接线；19.压力表；20.灌注管道。
具体实施例方式本发明为实现发现目的，从细胞种植和组织培养两个阶段入手，在细胞种植阶段，采用了细胞灌注的技术方案；在组织培养阶段，采用了灌流培养模拟体液环境、脉动训练模 拟应力环境。本发明通过模块化设计，将细胞灌注、灌流和脉动相关机构，在培养模块处通过两 个各自封闭但嵌套的腔的设计耦合在一起，成功实现了细胞种植阶段的细胞灌注和组织培 养过程中的同时或分步骤进行灌流培养和脉动训练。本发明提供的所述的灌注-灌流-脉动联合构建的生物反应器的结构原理如图1、 图2所示，它包括细胞灌注发生器8、灌流模块2、脉动发生器5、培养模块3和控制模块1 ； 所述的灌流模块2包括培养液储液瓶11和蠕动泵14，培养液储液瓶11和蠕动泵14之间 通过装有流速计12的第二灌流管道9b连接，在所述的培养液储液瓶的顶部装有空气过滤 器10 ；所述的培养模块3包括脉动腔6、脉动效应软管15和灌流腔7，所述的脉动腔和脉动 效应软管位于灌流腔内部，脉动腔下部与脉动效应软管15的上端连接，脉动效应软管的下 端封闭；脉动腔上部通过装有压力表19的脉动管道16与脉动发生器5连接；所述的灌流腔 7上部装有细胞悬液注入阀门17，该灌流腔通过第一灌流管道9a与培养液储液瓶11连通， 在灌流腔下部设有三通阀4，该三通阀的一个出口与灌流腔连通，另外两个出口分别通过第 二灌流管道9b和灌注管道20与蠕动泵14和细胞灌注发生器8连接；所述的细胞灌注发生 器、蠕动泵和脉动发生器均通过控制线路18与控制模块1连接。培养模块3、脉动腔6和灌流腔7均为圆桶状，各自密闭；培养模块应采用具有良 好生物相容性的材料制作。第一灌流管道9a、第二灌流管道9b和灌注管道20也应采用具 有良好生物相容性的材料制作。脉动效应管软管15应采用具有弹性和良好生物相容性的 材料制作，例如医用硅胶管等。所述的脉动发生器5由活塞和活塞缸组成，活塞缸中充满液体或气体介质。所述 的细胞灌注发生器8由活塞和活塞缸组成，活塞缸中充满气体介质。在所述的流速计、蠕动泵、脉动发生器和细胞灌注发生器上均设有传感器13，所述 的传感器通过控制线路与所述的控制模块1连接。生物反应器运行时，细胞灌注发生器8、蠕动泵14、流速计12、脉动发生器5、压力 表19和控制模块1，均放置于C02培养箱外部；培养模块3、三通阀4、培养液储液瓶11和空 气过滤器10放置于C02培养箱内部；生物反应器在培养箱内外机构通过第一灌流管道9a、 第二灌流管道％、灌注管道20和脉动管道16连接。本发明提供的灌注_灌流_脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器的实施方法 为将生物反应器的培养模块3、培养液储液瓶11、空气过滤器10、第一灌流管道9a、 第二灌流管道％、脉动管道16、灌注管道20、脉动发生器5的活塞和活塞缸部分、细胞灌注 发生器8的活塞和活塞缸部分、流速计12内腔和三通阀4进行灭菌处理，完成后放入无菌 通风柜组装。按照一定的方法制备所需要的组织工程心肌支架(本发明所述的生物反应器可 以培养的组织工程心肌支架可以为管道状，也可以为片状。如果是片状，应该卷成管道状)， 并进行该种支架需要的相应预处理。组织工程支架延径向的厚度，应适应灌流腔7的内径 与脉动效应软管15外径的差。将组织工程心肌支架套在脉动效应软管15外，安装于灌流腔7中。
细胞种植阶段1)将三通阀4调节为灌流腔7与第二灌流管道9b连通；2)打开细胞悬液注入阀门17，将细胞悬液加入灌流腔7 ；3)保持灌注管道20内为空气；4)将三向阀4调节为灌流腔7与灌注管道20连通；5)利用控制模块1启动细胞灌注发生器8，往复运动，先将细胞悬液吸入灌注管道 20，再推动灌注管道20中的空气柱，使细胞悬液进入灌流腔7中，如此使细胞悬液不断反复 通过组织工程支架，实现细胞的灌注种植。细胞灌注时间可视需要而定组织培养阶段1)在培养液储液瓶11中加入适量的培养液；2)将培养模块3、接有空气过滤器10的培养液储液瓶11放入C02培养箱中；3)三通阀4调节为灌流腔7与第二灌流管道9b连通；4)静置培养一段时间后或细胞灌注后直接利用控制模块1启动蠕动泵14，对灌流 腔7中的种有心肌细胞的组织工程心肌支架实施灌流培养；通过流速计12观察培养液循环 速度，信号反馈给控制模块1后可以按照程序控制培养液循环速度；5)灌流培养一段时间后或启动灌流培养的同时，利用控制模块1启动脉动发生器 5，脉动效应软管15产生脉动效果，组织工程心肌支架既受到脉动效应软管15外壁的“张 力”，也受到灌流腔7内壁的“压力”，对组织工程心肌进行应力刺激训练；通过压力表19可 以观察一段封闭的脉动效应软管内压力(通过压力可以得知脉动效应软管的脉动幅度)， 信号反馈给控制模块1后可以按照程序控制脉动效应软管内压力和脉动的频率。以下实施例用于说明本发明所述的生物反应器，但不用来限制本发明的范围。如 无特别指明，实施例中所用的胶原和试剂均购自Sigma公司。实施例1 管道状组织工程化心肌的构建液态胶原(1 % )与壳聚糖(1 %醋酸溶液)混合得到组织工程支架材料，使用管道 状模具，在低温下凝固后冷冻干燥24小时得到管道状支架。支架用多聚磷酸钠交联并调整 为中性，使用PBS冲洗后干燥备用。将支架安装于脉动效应软管，然后将生物反应器整体安 装成型。新分离的小鼠心肌细胞分散于培养液中得到细胞悬液，悬液浓度为106个细胞/mL。 4°C环境下，lml细胞悬液混入1ml浓度为10%的Metrigel溶液，将该混合溶液加入灌流腔 中，封闭加液口后，进行细胞灌注20分钟。细胞灌注后进行静态培养。1天后，启动灌流和 应力训练机构，继续培养6天后观察，可见支架内部心肌细胞存活并自主收缩。实施例2 长条状组织工程化心肌补片的构建按实施例1方法混合得到胶原_壳聚糖组织工程支架材料，使用长条状模具，在低 温下凝固后冷冻干燥24小时得到长条状支架。支架用多聚磷酸钠交联并调整为中性，使用 PBS冲洗后干燥备用。将支架沿长度方向，绕在脉动效应软管外，然后将生物反应器整体安 装成型。新分离的小鼠心肌细胞分散于培养液中得到细胞悬液，悬液浓度为106个细胞/mL。 4°C环境下，lml细胞悬液混入lml浓度为10%的Metrigel溶液，将该混合溶液加入灌流腔 中，封闭加液口后，进行细胞灌注20分钟。细胞灌注后进行静态培养。1天后，启动灌流和 应力训练机构，继续培养6天后观察，可见支架内部心肌细胞存活并自主收缩。实施例3 细胞灌注对组织工程心肌补片构建的影响
按实施例1方法混合得到胶原_壳聚糖组织工程支架材料， 并制备管道状支架。支 架用多聚磷酸钠交联并调整为中性，使用PBS冲洗后干燥备用。将支架安装于脉动效应软 管，然后将生物反应器整体安装成型。新分离的小鼠心肌细胞分散于培养液中得到细胞悬 液，悬液浓度为IO6个细胞/mL。4°C环境下，Iml细胞悬液混入Iml浓度为10%的Metrigel 溶液，将该混合溶液加入灌流腔中，封闭加液口后，进行细胞灌注20分钟。然后进行静态培 养，每隔24小时更换一次培养液。培养3天后观察，可见支架内部存在已经死亡的心肌细 胞，支架表面存在贴附的成活心肌细胞。
权利要求
一种灌注-灌流-脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，其特征在于所述的反应器包括细胞灌注发生器(8)、灌流模块(2)、脉动发生器(5)、培养模块(3)和控制模块(1)；所述的灌流模块(2)包括培养液储液瓶(11)和蠕动泵(14)，培养液储液瓶(11)和蠕动泵(14)之间通过装有流速计(12)的第二灌流管道(9b)连接，在所述的培养液储液瓶的顶部装有空气过滤器(10)；所述的培养模块(3)包括脉动腔(6)、脉动效应软管(15)和灌流腔(7)，所述的脉动腔和脉动效应软管位于灌流腔内部，脉动腔下部与脉动效应软软管(15)的上端连接，脉动效应软管的下端封闭；脉动腔上部通过装有压力表(19)的脉动管道(16)与脉动发生器(5)连接；所述的灌流腔(7)上部装有细胞悬液注入阀门(17)，该灌流腔通过第一灌流管道(9a)与培养液储液瓶(11)连通，在灌流腔下部设有三通阀(4)，该三通阀的一个出口与灌流腔连通，另外两个出口分别通过第二灌流管道(9b)和灌注管道(20)与蠕动泵(14)和细胞灌注发生器(8)连接；所述的细胞灌注发生器、蠕动泵和脉动发生器均通过控制线路(18)与控制模块(1)连接。
2.如权利要求1所述的灌注_灌流_脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，其特 征在于所述的培养模块(3)，脉动腔(6)和灌流腔(7)均为圆桶状，各自密闭；培养模块采 用具有生物相容性的材料制作。
3.如权利要求1所述的灌注_灌流_脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，其特 征在于所述的第一灌流管道(9a)、第二灌流管道(9b)和灌注管道(20)采用具有生物相 容性的材料制作。
4.如权利要求1所述的灌注_灌流_脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，其特 征在于所述的脉动效应管软管(15)采用具有弹性和生物相容性的材料制作。
5.如权利要求1所述的灌注_灌流_脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，其特 征在于所述的脉动发生器(5)由活塞和活塞缸组成，活塞缸中充满液体或气体介质。
6.如权利要求1所述的灌注_灌流_脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，其特 征在于所述的细胞灌注发生器(8)由活塞和活塞缸组成，活塞缸中充满气体介质。
7.如权利要求1所述的灌注_灌流_脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，其特 征在于在所述的流速计、蠕动泵、脉动发生器和细胞灌注发生器上均设有传感器(13)，所 述的传感器通过控制线路与所述的控制模块(1)连接。
全文摘要
灌注-灌流-脉动联合构建的组织工程心肌生物反应器，属于组织工程和生物工程制造技术领域。该生物反应器包括细胞灌注发生器、灌流模块、脉动发生器、培养模块和控制模块；细胞灌注发生器、灌流模块和脉动发生器通过管道与培养模块连通；培养模块包括脉动腔、一端封闭的脉动效应软管和灌流腔，灌流模块和脉动发生器进行灌流培养和脉动训练。本发明可提高心肌细胞种植深度、模拟心肌体内环境，培养得到厚度较大具有自主跳动能力的组织工程心肌。本发明所述的生物反应器，用于实现在细胞种植阶段进行细胞灌注、组织培养阶段同时或分步骤实施灌流培养和脉动训练的组织工程心肌构建。
文档编号C12M3/00GK101824382SQ201010133838
公开日2010年9月8日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者张人佶, 张婷, 林峰, 熊卓, 胡京奇, 颜永年 申请人:清华大学