一种高活性复合纤维素酶及其制备和应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种高活性复合纤维素酶及其制备和应用方法。其步骤如下：利用黑曲霉C112进行液体发酵生产β-葡萄糖苷酶，在一定培养条件下，所得β-葡萄糖苷酶酶活力可达15.496IU/ml。将黑曲霉C112生产的β-葡萄糖苷酶与里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶进行酶系复合，制备出高活性复合纤维素酶，当β-葡萄糖苷酶/滤纸酶比值为1.536时，酶解糖化稀磷酸与蒸汽爆破预处理杨木，获得最高还原糖61.858g/L，还原糖得率为81.63％。
CCTCC NO: M 2012129
2012.04.23
【专利说明】一种高活性复合纤维素酶及其制备和应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程【技术领域】，具体涉及一种利用生物技术手段制备高活性复合纤 维素酶，并涉及该复合纤维素酶在酶解糖化木质纤维素中的应用。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素是自然界中蕴藏量最丰富、最廉价的可再生资源，占地球总生物量 的40%左右。通过生物转化技术将天然纤维素降解为可以利用的糖，对于缓解地球能源 危机和环境污染具有重大意义。纤维素酶是指能降解纤维素的一类多组分复合酶系的总 称，主要包括三个酶组分：内切型 -P -葡聚糖酶（exd〇-l，4-0 -D-glucanase，EG)、外切 型-￠-葡聚糖酶（ex〇-l，4-0-D_glucanase，CHB)和 ￠-葡萄糖苷酶（0-glucosidase， BG)。纤维素酶的作用机理是EG先降解纤维素分子内部的非结晶区形成新的游离末端；然 后由CHB作用于纤维素线状分子非还原性末端水解P-1，4-糖苷键形成纤维二糖；最后由 BG水解纤维二糖为2个葡萄糖。
[0003] 在纤维素的酶解糖化过程中，若BG型酶不能有效的酶解纤维二糖，将会对EG酶和 CHB酶产生很强的反馈抑制作用，最终限制纤维素的酶解糖化率。为提高纤维素酶的酶解 糖化率，十分有必要通过人工措施制备具有高活性EG、CHB和BG型纤维素酶的复合纤维素 酶。目前公认的能产生高活性EG和CHB型纤维素酶的菌种为里氏木霉，而该菌种所产的BG 型纤维素酶活性较低。目前能产生高活性BG型纤维素酶的菌种为黑曲霉。将黑曲霉生产 的￠-葡聚糖苷酶与里氏木霉生产的纤维素酶复合制备出高活性复合纤维素酶，优化酶系 配比，提高木质纤维素的酶解得率，具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高活性复合纤维素酶及其制备方 法和其在酶解糖化木质纤维素中的应用，本发明能够显著提高酶解糖化木质纤维素的效 率，尤其能够提高对于蒸汽爆破杨木的酶解效率。
[0005] -种高活性复合纤维素酶的制备方法，分别将保藏编号为CCTCC NO :M 2012129 的黑曲霉C112生产的￠-葡萄糖苷酶与保藏编号为ATCC 56765的里氏木霉RUT C30生 产的纤维素酶浓缩提纯，并将浓缩后的酶液混合使得3 _葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为 1.048?2. 685;黑曲霉C112通过产￠-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的￠-葡萄糖苷 酶，培养基配方为：玉米芯25?30g/L，稻草粉20?30g/L，蛋白胨5?6g/L，（NH 4)2SO4IO? 13g/L，KH2P0 46 ?8g/L，CaCl2 .2H20 0? 5 ?I. 0g/L，MgS04.7H20 0? 5 ?I. Og/L，吐温-801 ? 2ml/L，Mandels微量元素浓缩液0. 5?lml/L，lmol/L柠檬酸缓冲液100?150ml/L，加水 配制成1L。
[0006] 上述方法优选将浓缩后的酶液混合使得3 _葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为 1.536 ;黑曲霉C112通过产￠-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的￠-葡萄糖苷酶，培养基 配方为：玉米芯 25g/L，稻草粉 30g/L，蛋白胨 5g/L，（NH4) 2S0410g/L，KH2P046g/L，CaCl 2 *2H20 0? 9g/L，MgSO4 ? 7H20 0? 9g/L，吐温-801ml/L，Mandels 微量元素浓缩液 lml/L，lmol/L 柠檬 酸缓冲液l〇〇ml/L，加水配制成1L。
[0007] 上述方法中黑曲霉C112的产￠-葡萄糖苷酶的培养过程如下：将黑曲霉菌C112 的种子培养液，以体积百分比5-8 %的接种量接种于装有40-60ml产酶培养基的250ml摇瓶 中，26-28°C，180-220r/min条件下培养4-6天，离心，取上清液得到粗酶液。
[0008] 黑曲霉C112的种子培养：从保存的黑曲霉C112土豆固体平板培养基中挑取孢子， 接种于装有40-60ml种子培养基的250ml摇瓶中，26-28°C，180-220r/min条件下培养2? 3天作为接种物；黑曲霉Cl 12种子培养基：马铃薯250?300g/L，葡萄糖15?25g/L，pH值 6. 5 ?7. 0〇
[0009] 上述方法黑曲霉Cl 12生产的纤维素酶￠-葡萄糖苷酶活为13. 368?15. 496U/ mL，滤纸酶活为0. 183?0. 215IU/mL，经超滤浓缩仪浓缩后，P -葡萄糖苷酶活为18. 793? 24. 741U/mL，滤纸酶活为0. 785?0. 932IU/mL ;里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶P -葡萄 糖苷酶活为1. 205?I. 652U/mL，滤纸酶活为5. 931?6. 212IU/mL ;经超滤浓缩仪浓缩后， 3 -葡萄糖苷酶活为9. 379?12. 662U/mL，滤纸酶活为43. 335?48. 912IU/mL。
[0010] Mandels 微量元素浓缩液配方为：FeSO4 ? 7H20 5g/L，MnSO4 ? H2O I. 6g/L， ZnSO4 ? 7H20 I. 4g/L，CoCl2 ? 6H20 3. 7g/L，加水配制成 IL ;
[0011] lmol/L 柠檬酸缓冲液的配方为：柠檬酸（C6H8O7 ? H2O) 210g，H2O 750ml，加 NaOH 78g，冷却后测pH为4. 2,加水至1000ml，pH 4. 5。
[0012] 一种高活性复合纤维素酶，是由所述的制备方法制备而成的。
[0013] 所述的高活性复合纤维素酶的应用方法，将所述的高活性复合纤维素酶用于酶解 糖化木质纤维素。
[0014] 具体是将粉碎后的杨木屑与质量浓度0. 05-5. 0 %的稀磷酸按固液比1:1-1:10 预浸渍l_24h后进行蒸汽爆破，蒸汽爆破条件：蒸汽爆破压强为0. 5-3Mpa，保压时间为 60-240S ;将所得蒸汽爆破产物，加入0. 05-0. lmol/L，pH4. 8的柠檬酸缓冲液，再用0. 5? lmol/L的氨水调节pH至4. 5-6. 0,同时调整底物体积浓度为5 %?20 %，以滤纸酶活FPU 为15?30IU/g底物加入复合酶，P -葡萄糖苷酶/滤纸酶的值为1. 048?2. 685时，酶解 温度为 45-55°C，pH 为 4. 6-5. 0,酶解 8 ?64h。
[0015] 上述应用方法优选将粉碎后的杨木屑与质量浓度0. 05-2. 0%的稀磷酸按固液比 1:1-1:10预浸渍l_12h后进行蒸汽爆破，蒸汽爆破条件：蒸汽爆破压强为0. 5-2. 5Mpa，保压 时间为90-220S ;将所得蒸汽爆破产物，加入0. 05mol/L，pH4. 8的柠檬酸缓冲液，再用Imol/ L的氨水调节pH至4. 5-6. 0,同时调整底物体积浓度为10%，以滤纸酶活FPU为15IU/g底 物加入复合酶，P -葡萄糖苷酶/滤纸酶的值为1. 536时，酶解温度为50°C，pH为4. 8,酶解 64h〇
[0016] 本发明的黑曲霉C112 Aspergillus nigei* C112,2012年4月23日保藏于《中国 典型培养物保藏中心》，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC N0:M 2012129。
[0017] 本发明所用里氏木霉RUT C30 (Trichoderma reesei RUT C30)，购自美国模式菌种 收集中心（ATCC)，编号：ATCC 56765,其产纤维素酶生产方法，见参考文献3。
[0018] 本发明通过大量探索试验获得利用黑曲霉产高活性P _葡聚糖苷酶的培养基，将 黑曲霉生产的3-葡聚糖苷酶与里氏木霉生产的纤维素酶复合制备出高活性复合纤维素 酶，优化酶系配比，大大提高木质纤维素的酶解得率，具有重要的现实意义。本发明的应用 可开辟新的纤维素酶制备技术，为高效、低成本酶解木质纤维素提供技术保障。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为本发明单一碳源对黑曲霉C112产￠-葡萄糖苷酶的影响；
[0020] 图2为本发明单一氮源对黑曲霉C112产￠-葡萄糖苷酶的影响；
[0021] 图3为本发明黑曲霉C112摇瓶产P -葡萄糖苷酶活随时间的变化曲线；
[0022] 图4为本发明P _葡萄糖苷酶/滤纸酶比值对还原糖的影响；
[0023] 图5为本发明复合纤维素酶酶解糖化蒸汽爆破杨木得到还原糖量随时间的变化 曲线。
【具体实施方式】
[0024] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0025] 实施例1 :本发明提供了单因素和正交试验对黑曲霉C112产￠-葡萄糖苷酶工艺 的优化过程，具体如下。
[0026] 黑曲霉C112的种子培养：从实验室保存的黑曲霉C112 土豆固体平板培养基中挑 取两环孢子，接种于装有50ml 土豆培养基的250ml摇瓶中，28°C，200r/min条件下培养 2?2. 5天作为接种物。黑曲霉Cl 12种子培养基：马铃薯300g/L，葡萄糖20g/L，pH值6. 80。
[0027] 黑曲霉C112的产酶培养：将活化好的黑曲霉菌液，以6% (v/v)接种量接种于装 有50ml产酶培养基的250ml摇瓶中，28°C，200r/min条件下培养5天。所有摇瓶实验均为 3个平行。4000r/min下离心lOmin，取上清液（粗酶液）测定其￠-葡萄糖苷酶活力。
[0028] 用于筛选培养基的最优单因素的黑曲霉C112产酶基本培养基：玉米芯30. 7g/ L，麸皮 l〇g/L，酵母粉 5g/L，（NH4) 2S047g/L，KH2P046g/L，CaCl 2 ? 2H20 0? 9g/L，MgSO4 ? 7H20 0. 9g/L，吐温-801ml/L，Mandels微量元素浓缩液lml/L，lmol/L朽1檬酸缓冲液100ml/L。
[0029] 其中，Mandels 微量元素浓缩液：FeSO4 *7H20 5g/L，MnS04 .H2O I. 6g/L，ZnS04 *7H20 1. 4g/L，CoCl2 ? 6H20 3. 7g/L ;加水至 1000ml。
[0030] lmol/L 柠檬酸缓冲液：柠檬酸（C6H8O7 ? H2O) 210g，H2O 750ml，加 NaOH 78g，冷却后 测pH约为4. 2,加水至1000ml，pH约为4. 5。
[0031] 本发明所采用￠-葡萄糖苷酶活力的P-NPG测定法，见参考文献1。
[0032] 产酶培养基单因素试验：保持产酶液体培养基中其他成分不变，分别改变碳源、复 合碳源、氮源、复合氮源这四个因素，筛选出黑曲霉C112产酶培养基的最优单因素。
[0033] 保持产酶培养基中其他成分不变，分别加入1.0%、1.5%、2. 0%的麸皮、玉米芯、 稻草粉、微晶纤维素、麦芽浸粉和乳糖作为碳源，比较不同浓度的单一碳源对黑曲霉C112 产葡萄糖苷酶的影响（图1)。结果表明，玉米芯和稻草粉的产酶效果较好，其中在浓度 为2. 0%时，玉米芯和稻草粉的P -葡萄糖苷酶活力分别达到3. 577U/mL和3. 320U/mL。表 明玉米芯和稻草粉对黑曲霉的诱导产酶能力较强。
[0034] 选取单一碳源中效果较好的玉米芯与稻草粉，研究不同浓度的复合碳源对黑曲霉 Cl 12产￠-葡萄糖苷酶的影响（表1)。当玉米芯为2%，稻草粉为3%时，￠-葡萄糖苷酶 活力最高达到8. 768U/mL。
[0035] 表1复合碳源对黑曲霉Cl 12产P -葡萄糖苷酶的影响
【权利要求】
1. 一种高活性复合纤维素酶的制备方法，其特征在于，分别将保藏编号为CCTCC NO: Μ 2012129的黑曲霉C112生产的β-葡萄糖苷酶与保藏编号为ATCC 56765的里氏木霉 RUT C30生产的纤维素酶浓缩提纯，并将浓缩后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸 酶活比值为1.048?2.685 ;黑曲霉C112通过产β-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的 β -葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25?30g/L，稻草粉20?30g/L，蛋白胨5?6g/ L，（NH4)2S0410 ?13g/L，KH2P046 ?8g/L，CaCl2 · 2H20 0· 5 ?1. Og/L，MgS04 · 7H20 0· 5 ? 1. Og/L，吐温-801?2ml/L，Mandels微量元素浓缩液0. 5?lml/L，lmol/L朽1檬酸缓冲液 100?150ml/L，加水配制成1L。
2. 根据权利要求1所述的高活性复合纤维素酶的制备方法，其特征在于，浓缩后的酶 液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.536;黑曲霉C112通过产β-葡萄糖 苷酶的培养基得到高活力的β -葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25g/L，稻草粉30g/ L，蛋白胨 5g/L，（NH4)2S0410g/L，KH2P0 46g/L，CaCl2 · 2H20 0· 9g/L，MgS04 · 7H20 0· 9g/L，吐 温-801ml/L，Mandels微量元素浓缩液lml/L，lmol/L柠檬酸缓冲液100ml/L，加水配制成 lL〇
3. 根据权利要求1所述的高活性复合纤维素酶的制备方法，其特征在于， 黑曲霉C112的产β -葡萄糖苷酶的培养过程如下：将黑曲霉菌C112的种子培养液， 以体积百分比5-8%的接种量接种于装有4〇-6〇1111产酶培养基的25〇1111摇瓶中，26-281：， 180-220r/min条件下培养4-6天，离心，取上清液得到粗酶液。
4. 根据权利要求3所述的高活性复合纤维素酶的制备方法，其特征在于， 黑曲霉C112的种子培养：从保存的黑曲霉C112 土豆固体平板培养基中挑取孢子，接 种于装有40-60ml种子培养基的250ml摇瓶中，26-28°C，180-220r/min条件下培养2?3 天作为接种物；黑曲霉C112种子培养基：马铃薯250?300g/L，葡萄糖15?25g/L，pH值 6. 5 ?7. 0〇
5. 根据权利要求1所述的高活性复合纤维素酶的制备方法，其特征在于， 黑曲霉C112生产的纤维素酶β -葡萄糖苷酶活为13. 368?15. 496U/mL，滤纸酶活为 0. 183?0. 215IU/mL，经超滤浓缩仪浓缩后，β -葡萄糖苷酶活为18. 793?24. 741U/mL， 滤纸酶活为0. 785?0. 932IU/mL ;里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶β -葡萄糖苷酶活为 1. 205?1. 652U/mL，滤纸酶活为5. 931?6. 212IU/mL ;经超滤浓缩仪浓缩后，β -葡萄糖苷 酶活为 9. 379 ?12. 662U/mL，滤纸酶活为 43. 335 ?48. 912IU/mL。
6. 根据权利要求1所述的高活性复合纤维素酶的制备方法，其特征在于，Mandels 微量元素浓缩液配方为：FeS04 · 7H20 5g/L，MnS04 · H20 1. 6g/L，ZnS04 · 7H20 1. 4g/L， CoCl2 · 6H203. 7g/L，加水配制成 1L ; lmol/L柠檬酸缓冲液的配方为：柠檬酸（C6H807，H20)210g，H 20 750ml，加 NaOH 78g，冷 却后测pH为4· 2,加水至1000ml，pH 4· 5。
7. -种高活性复合纤维素酶，其特征在于，是由权利要求1-6任一项所述的制备方法 制备而成的。
8. 权利要求7所述的高活性复合纤维素酶的应用方法，其特征在于，将所述的高活性 复合纤维素酶用于酶解糖化木质纤维素。
【文档编号】C12R1/685GK104293746SQ201410456979
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】陈介南, 詹鹏, 王芳, 张 林, 王挥, 刘进, 陈立君 申请人:中南林业科技大学, 长沙联美生物科技有限责任公司