基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物。用于检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物，由SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。本发明所述的引物组合物在检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。本发明的检测体系在62℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆禾谷镰孢菌，不需要复杂仪器，能较好满足对大豆禾谷镰孢菌的现场检测。
【专利说明】基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组 合物
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法 及引物组合物。
【背景技术】
[0002] 大豆镰刀菌根腐病主要危害大豆根系，影响作物对水分和养分的吸收。此病的 发生可使大豆植株的根活性、根重、根瘤重、固氮酶活性以及侧根数等均受到不同程度的 影响，最早是由Crommell在1917年报道于美国。据调查病害该病可使大豆一般减产 10% -30%，严重时可达60%。现已知该病分布于中国、美国、印度、日本及菲律宾等国，是 严重影响我国东北和黄淮海地区大豆生产的重要病害，在黑龙江省三江平原尤为严重。
[0003] 大豆镰刀菌根腐病可由多种镰孢菌侵染引起，迄今中国已报道的镰孢菌有尖孢 镰孢菌（F.oxysporum)、爺腐镰孢菌（F.solani)、木贼镰孢菌（F.equiseti)、禾谷镰孢菌 (F.graminearum)、燕麦镰孢菌（F.aveneum)、半裸镰孢菌（F. semitectum)等。本发明针对 大豆禾谷镰孢菌的分子检测进行了一系列的研究。
[0004] 传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，将菌种鉴定到纲、目、科、属、种。然 而真菌的形态特征复杂，且有些菌类形态特征和生理生化特征随着环境的变化而不稳定， 因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏 度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病 害发生进行及时的监测和有效控制。
[0005] 随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为真菌的分类鉴定提供了技术条 件。同工酶分析、RFLP、PFGE、RAPD以及DNA序列分析等技术为研究真菌的遗传变异提供了 有利的手段。应用特导性的引物PCR扩增真菌DNA是一种较常规技术，具有灵敏度高、快速 的特点。
[0006] 目前用于检测大豆禾谷镰孢菌的方法有PCR，Real - time PCR，分子标记等，虽然 这些方法在特异性和灵敏度上有较大的提高，但是需要依赖精密的温度循环装置，检测过 程复杂，不能满足快速检测的需求。
[0007] 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是日本 的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等 优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种 特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60?65°C范围60min 内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增 过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条 件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。
[0008] 此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染 的一个主要来源；而且溴化乙锭（EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人 员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过加入 SYBR Green I观察颜色和荧光变化便可直接判断结果，大大降低了对实验人员的伤害，并 且增加了在田间的应用价值。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对现有技术中大豆禾谷镰孢菌的生物学检测方法所需周期长、 费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测大豆禾谷 镰孢菌的问题，而提供了大豆禾谷镰孢菌新的分子检测方法，对大豆禾谷镰孢菌进行LAMP 检测，检测周期短（仅需lh)、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。
[0010] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0011] SEQ ID NO. 1所示的大豆禾谷镰孢菌CYP51C基因序列作为靶标在LAMP检测大豆 禾谷镰孢菌中的应用。
[0012] 用于检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物，由SEQ ID NO. 2所示的正向内引物 FIP、SEQ ID NO. 3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO. 4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO. 5 所示的反向外引物B3、SEQ ID NO. 6所示的环引物LB组成。
[0013] 本发明所述的引物组合物在检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。
[0014] 本发明所述的引物组合物在制备大豆禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂中的应用。
[0015] 一种检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，含有本发明所述的引物组合物。
[0016] 所述的检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，优选包含检测溶液以及染料SYBR Green I ;其中所述的检测溶液由：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外 引物 F3、8mM 反向外引物 B3、8mM 环引物 LB、56mM dNTPs、0.8M Tris -HCl(pH8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2S04、0.24mM MgS04、4% Triton X-KKKBst DNA polymerase320 单位/mL, 加入超纯水制备得到。
[0017] 一种检测大豆禾谷镰孢菌的方法，取待检微生物DNA，以该DNA为模板，利用本发 明所述的引物组合物进行LAMP;扩增反应结束后，加入染料SYBR Green I，日光下目测或 在245nm波长紫外光照射观察荧光；以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定 标准：日光下目测呈黄绿色表示检测结果为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，日光下目测呈黄色 表示检测结果为阴性，不存在大豆禾谷镰孢菌；紫外光下，发强烈的绿色荧光表示检测为阳 性，存在大豆禾谷镰孢菌，没有荧光表示检测为阴性，不存在大豆禾谷镰孢菌。
[0018] 8、根据权利要求7所述的检测大豆禾谷镰孢菌的方法，其特征在于LAMP反应程序 为：62°C，60min。
[0019] 有益效果
[0020] 靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖 体基因转录间隔区（Internal transcribed space, ITS),然而许多学者认为该祀标不能够 很明确的区分镰孢属真菌。
[0021] CYP51基因编码的甾醇14α -去甲基化酶是分布最广的细胞色素 P450家族成 员，是生物留醇合成过程中的关键酶。在人类基因和植物病原真菌中发现了多个拷贝的 CYP51基因，如曲霉菌、稻瘟菌等中含有两种拷贝CYP51A、CYP51B。另外还存在第三种拷贝 CYP51C，被发现特异地存在于镰孢菌种基因中。发明人以普通PCR技术检测大豆尖孢镰孢 菌的研究中发现，CYP5IC基因序列在Fusarium种内不同菌株间高度保守，种间存在丰富的 变化，是相比rDNA - ITS、β - tubulin序列更好的分子检测祀标。
[0022] 本发明分析了大豆禾谷镰孢菌CYP51C基因和其他镰孢菌在序列上的差异，选取 特定区域，设计了四条特异性的LAMP引物和一条环引物，在此基础上建立了检测大豆禾谷 镰孢菌的LAMP体系。
[0023] 本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
[0024] (1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验 室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭（EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对 实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过 SYBR Green I的颜色和荧光变化便可直接判断结果，从而增加了其在田间的应用价值。
[0025] (2)恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只 要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了 LAMP使用的范围，LAMP之所以能在 恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态 平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。
[0026] (3)准确性高。由于传统大豆禾谷镰孢菌检测技术只是根据形态特征来确定检 疫对象，鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰；而本发明根据 大豆禾谷镰孢菌的CYP51C序列，该序列在大豆禾谷镰孢菌中的基因组中非常保守，利用 Bioedit软件将大豆禾谷镰孢菌的CYP51C序列和其他镰孢菌的CYP51C序列进行比较，选取 大豆禾谷镰孢菌特有的一段CYP51C序列设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物 特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特 异性和灵敏度都比较高。
[0027] 说明书附图
[0028] 图ILAMP检测大豆禾谷镰孢菌阳性结果和阴性结果示意图。其中，作左图为目测 结果图，右图为紫外光下观测结果；每幅照片中左边的EP管为阳性结果，右边的EP管为阴 性结果。
[0029] 图2LAMP检测大豆禾谷镰孢菌的特异性
[0030] 通过对镰孢属8个其它种的菌株共计180个菌株，以及和10个其它属病原菌菌 株共计57个菌株进行了 LAMP扩增，特异性LAMP反应只能在供试的F. graminearum菌株 中产生黄绿色的颜色变化与产生绿色荧光（1 - 3 :大豆禾谷镰孢菌菌株；4 :层出镰孢菌；5 : 木贼镰孢菌；6 :尖孢镰孢菌；7 :茄腐镰孢菌；8 :雪腐镰孢菌；9 :燕麦镰孢菌；10 :串珠镰孢 菌；11 :黄色镰孢菌；12 :米曲霉菌；13 :链格孢菌；14 :胶胞炭疽菌；15 :平头炭疽菌；16 :大 ?镑囷；17 :大?拟圣点肿腐病囷；18 :大?疫霉囷；19 :大?炭腐病囷；20 :稻癌囷；21 :油 瓶霉菌；22:阴性对照。）上两排为目测结果，下两排为紫外光下观测结果。
[0031] 图3LAMP检测大豆禾谷镰孢菌的灵敏度
[0032] LAMP扩增不同浓度基因组DNA ;25yL的反应体系中分别含有100ng、10ng、lng、 100pg、10pg、lpg、IOOfgUOfg DNA 的扩增结果。
[0033] 颜色和荧光判定LAMP检测大豆禾谷镰孢菌菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄 绿色并有强烈的绿色荧光，阴性对照为黄色，不显荧光。结果表明LAMP反应的灵敏度达到 100pg。第一排为目测结果，第二排为紫外光下观测结果。
[0034] 图4LAMP检测发病植株中的大豆禾谷镰孢菌
[0035] 取被禾谷镰孢菌侵染的大豆植物组织，提取基因组，进行LAMP扩增。颜色和荧光 判定LAMP反应能够检测侵染植物中的禾谷镰孢菌。（1 - 4 :发病植株；5 :禾谷镰孢菌基因 组；6 :健康植株；7 :空白阴性对照。）第一排为目测结果，第二排为紫外光下观测结果。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1田间采集植株中检测大豆禾谷镰孢菌
[0037] 大豆禾谷镰孢菌检测试剂盒，包括以下成分：
[0038] 大豆禾谷镰孢菌LAMP分子检测的四条特异性引物FIP、BIP、F3、B3和一条环引物 LB ：
[0039] F3(正向外引物）：GGGATCCTCATCGTTGGGA(19bp，SEQ ID NO. 4);
[0040] B3(反向外引物）：AGGCTGTTCAATGTGAACCA(20bp，SEQ ID NO. 5);
[0041] FIP (正向内引物）（F1C+F2)
[0042] TGACGGATTTGCTCATCACCCCGAAGACCGCCGAAGATGG(40bp, SEQ ID NO. 2)；
[0043] BIP(反向内引物）（B1C+B2):
[0044] TTGCCCTTTGGAGCTGGACGGTGGCAACAATAGCTCCCA(39bp, SEQ ID NO. 3)〇
[0045] LB(环引物）：ACATCGATGTGTTGGCGAGAATTA(24bp，SEQ ID NO. 6)
[0046] 试剂盒反应体系
[0047] ImL检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物 F3、8mM 反向外引物 B3、8mM 环引物 LB、56mM dNTPs、0.8M Tris-HCl(pH 8.8)、0.4mM KC1、 0· 4mM(NH4)2S04、0. 24mM MgS04、4% Triton X - 100、Bst DNA polymerase 320 单位，加入 超纯水制备成ImL检测溶液；染料SYBR Green I 25 μ L。保存期限为I年。
[0048] 实施例2
[0049] 为了验证LAMP方法的特异性，选择大豆禾谷镰孢菌菌株，与禾谷镰孢不同种的镰 孢菌菌株（层出镰孢菌；木贼镰孢菌；尖孢镰孢菌；茄腐镰孢菌；雪腐镰孢菌；燕麦镰孢菌； 串珠镰孢菌；黄色镰孢菌），以及与大豆尖镰孢不同属的菌株（米曲霉菌；链格孢菌；胶胞 炭疽菌；平头炭疽菌；大豆锈菌；大豆拟茎点肿腐病菌；大豆疫霉菌；大豆炭腐病菌；稻瘟 菌；油瓶霉菌）的DNA作为模板，取4 μ I DNA溶液，利用实施例1的检测试剂盒，进行LAMP 反应，LAMP反应程序为：62°C，60min，扩增反应结束后，加入染料SYBR Green I，日光下目测 或在245nm波长紫外光照射观察荧光。结果显示用LAMP引物去扩增大豆木贼镰孢菌的DNA 模板时，产生黄绿色的颜色变化与产生绿色荧光；而其他的菌株与阴性对照一样，没有颜色 变化或者强烈的绿色荧光（图2)。
[0050] 实施例3
[0051] 为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的大豆禾谷镰孢菌菌株的DNA用分光光 度计测定浓度（1 μ g/μ 1)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70°c保存作为模板。分别取10 倍比稀释后的各浓度DNA稀释液4 μ L作为模板，按实施例2的方法，进行LAMP反应和结果 观察。结果显示LAMP方法可以检测到浓度是IOOpg的大豆禾谷镰孢菌的DNA (图3)
[0052] 实施例4从海关进境大豆带菌土样中检测大豆禾谷镰孢菌：
[0053] 上述大豆禾谷镰孢菌检测试剂盒用于检测大豆禾谷镰孢菌的方法，包括：
[0054] 1) 土壤中卵孢子的富集：
[0055] 取待检土壤样品20克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400、 500、800目筛网过滤，同时用3升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用Iml水悬浮。 由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。
[0056] 2)从微量卵孢子中提取DNA :
[0057] 将用无菌水悬浮的卵孢子转移到I. 5mL的离心管中，在12000r. min - 1转速下离 心5分钟，倒出液体；
[0058] 加入 50 μ L CTAB buffer，研磨，再加入 500 μ L CTAB buffer，水浴 30 分钟；
[0059] 加入等体积氯仿抽提，在12000r · min _1转速下离心10分钟，吸取上清；
[0060] 加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟， 12000r · min _ 1转速下离心10分钟，倒干液体；
[0061] 力口 ImL 70% (V/V)乙醇洗涤，12000r · miiT1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干 至无酒精味；
[0062] 加 10 μ L无菌双蒸水溶解，用于LAMP扩增的模板。
[0063] 3)大豆禾谷镰孢菌LAMP检测，包括：
[0064] (1)大豆禾谷镰孢菌的LAMP检测：取4 μ L DNA溶液，加入18 μ L试剂盒溶液和 3 μ L灭菌去离子水，总体积为25 μ L ;
[0065] (2)反应程序为：62°C，60min ;
[0066] (3)扩增产物的检测：扩增后加入0· 25 μ L染料SYBR Green I作为反应指示剂， 肉眼观察，以及245nm波长紫外光照射观察荧光。以SYBR Green I的颜色变化和荧光强 弱做为结果判定标准。日光下，黄绿色表示检测为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，黄色表示检 测结果为阴性；紫外光下，强烈的绿色荧光表示检测为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，没有荧 光表示检测为阴性。
[0067] 实施例5从发病大豆组织中鉴定大豆禾谷镰孢菌
[0068] 将被病原物侵染的大豆叶片或根茎部位用70%酒精消毒后，采用改进的NaOH法 提取DNA。取一段新发病的植株组织，每毫克组织加入IOyL 0. 5mol/L NaOH，在研钵中充 分研磨后转移至I. 5mL的离心管中，12000r · min_1转速下离心5min，取5μ L上清液加入 495 μ L 0. lmmol/L Tris (ρΗ8. 0)，混匀后吸取4uL DNA溶液，按实施例2的方法，进行LAMP 反应，结果见图4,可见发病植株管在日光下目测为黄绿色，紫外光下产生绿色荧光，与禾谷 镰孢菌基因组管的颜色相同；证明所检测的病原为大豆禾谷镰孢菌；而健康植株和空白阴 性对照则在日光下目测为黄色，紫外管辖无荧光。
【权利要求】
1. SEQ ID NO. 1所示的大豆禾谷镰孢菌CYP51c基因序列作为靶标在LAMP检测大豆禾 谷镰孢菌中的应用。
2. 用于检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO. 2所示的 正向内引物FIP、SEQ ID NO. 3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO. 4所示的正向外引物F3、 SEQ ID NO. 5所示的反向外引物B3、SEQ ID NO. 6所示的环引物LB组成。
3. 权利要求2所述的引物组合物在检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。
4. 权利要求2所述的引物组合物在制备大豆禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂中的应用。
5. -种检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，其特征在于含有权利要求2所述的引物组 合物。
6. 根据权利要求5所述的检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，其特征在于所述的试 剂盒包含检测溶液以及染料SYBR Green I ;其中所述的检测溶液由：32mM正向内引物FIP、 32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、56mM dNTPs、 0? 8M Tris - HCl (pH 8. 8)、0? 4mM KC1、0. 4mM(NH4)2S04、0. 24mM MgS04、4% Triton X - 100、 Bst DNA polymerase 320单位/mL,加入超纯水制备得到。
7. -种检测大豆禾谷镰孢菌的方法，其特征在于取待检微生物DNA，以该DNA为模板， 利用权力要求2所述的引物组合物进行LAMP;扩增反应结束后，加入染料SYBR Green I，日 光下目测或在245nm波长紫外光照射观察荧光；以SYBRGreen I的颜色变化和荧光强弱做 为结果判定标准：日光下目测呈黄绿色表示检测结果为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，日光下 目测呈黄色表示检测结果为阴性，不存在大豆禾谷镰孢菌；紫外光下，发强烈的绿色荧光表 示检测为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，没有荧光表示检测为阴性，不存在大豆禾谷镰孢菌。
8. 根据权利要求7所述的检测大豆禾谷镰孢菌的方法，其特征在于LAMP反应程序为： 62°C,60min。
【文档编号】C12R1/77GK104313128SQ201410456539
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】郑小波, 陆辰晨, 王源超, 张海峰 申请人:南京农业大学