一种快速检测鹿粘膜病病毒bvdv的方法
【专利摘要】本发明提供了一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，通过将LDR与PCR技术相结合的检测导致梅花鹿粘膜病的BVDV，具体为：首先，从NCBI中下载BVDV全序列，通过软件比对BVDV的5’-UTR进行病毒特异性序列的设计，并以副猪嗜血杆菌的引物为通用引物进行探针合成；探针包括上游探针和下游探针，上游探针从左到右依次是上游通用引物对应序列、上游病毒特异序列，下游探针从左到右依次是下游病毒特异序列、下游通用引物对应序列。以病毒基因组RNA反转录的cDNA为模板进行LDR、PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。此方法的建立对鹿粘膜病病毒的流行病学调查和疫情控制具有重要的意义。
【专利说明】一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于畜牧兽医学领域，尤其涉及一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法。
【背景技术】
[0002] 梅花鹿的粘膜病，是由牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一种以发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、免疫耐受与持续感染、 免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、怀孕母牛流产、产死胎或畸形胎为主要特征的一种接触性传 染病。许多方法被用于检测BVDV。早期检测BVDV的常规方法包括病毒分离鉴定、免疫荧光 技术、酶联免疫吸附方法等，但这些方法费时、费力，实验条件要求较高，灵敏度和特异性不 高。近来，PCR、LAMP等分子生物学方法被广泛用于BVDV检测，但这些方法亦存在假阳性问 题。连接酶检测反应（LDR)其反应原理类似聚合酶链反应（PCR)，而反应特异性高于PCR。 当探针与目的DNA互补配对后，连接酶能通过催化磷酸二酯键将相邻的两条探针连接，当 探针的接头处存在碱基错配时，连接反应便不能进行。LDR技术具有特异性高、通用性好、适 用范围广等特点，通过整合入其它生物技术，在生物分子检测中取得了更大的进展。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，旨在解决对地 区内梅花鹿粘膜病病毒流行病学调查以及净化鹿场和快速对诊断梅花鹿粘膜病进行快速 诊断。
[0004] 本发明是这样实现的，一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，包括以下步骤：
[0005] (1)探针的设计
[0006] 根据BVDV的5' -UTR设计病毒特异性序列，以副猪嗜血杆菌的引物为通用引物序 列，得到探针，所述探针包括：
[0007] 上游探针序列（5' -3'）：
[0008] TTACCGGCGAGAAGAGTTGGGCATAGCGAGGGCATGCCCACAGCACATCT ；
[0009] 下游探针序列（5' -3'）：
[0010] TAACCTGGACGGGGGTCGCCTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT ；
[0011] ⑵BVDV的检测
[0012] 通过上述上、下游探针以病毒基因组RNA反转录的cDNA模板进行LDR反应，得到 连接产物；
[0013] 通过上述通用引物序列以所述连接产物为模板进行PCR反应，得到扩增产物，琼 脂糖凝胶电泳检测电泳产物确定BVDV。
[0014] 优选地，在步骤（1)中，所述通用引物序列包括：
[0015] 上游通用引物序列（5' -3'）：
[0016] AATGGCCGCTCTTCTCAACCCGTATC ；
[0017] 下游通用引物序列（5' -3'）：
[0018] CTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT。
[0019] 优选地，在步骤（1)中，所述病毒特异性序列包括：
[0020] 上游病毒特异序列（5' -3'）：
[0021] CGAGGGCATGCCCACAGCACATCT ；
[0022] 下游病毒特异序列（5' -3'）：
[0023] TAACCTGGACGGGGGTCGCC。
[0024] 优选地，在步骤⑵中，所述LDR反应具体为：以BVDV的cDNA为模板，进行LDR 连接反应，并对LDR反应体系和反应参数进行优化，优化后的反应体系为：50 μ Μ上、下游 探针各 1. 0 μ 1，2U Taq DNA 连接酶（40U/ μ 1)，约 20ng/ μ 1 cDNAl. 0 μ 1，10 X LDR Buffer 1· 0μ 1，ddH20 补齐至 10μ 1。反应条件：94°C预变性 3min，94°C变性 30s，68. 4°C 4min，10 个循环。
[0025] 优选地，在步骤⑵中，所述PCR反应具体为：以连接产物为模板，总体积25 μ 1的 PCR反应体系包括lOXBuffer 2.5yl，25mM MgCl22.0yl，上游通用引物（10μΜ)和下游 通用引物（1〇μΜ)各 0· 5μ 1，2· 5mM dNTP2. Ομ l，Taq DNA 聚合酶（5υ/μ 1)0. 25μ 1，LDR 连 接产物 1· Ομ 1。反应条件：94°C 3min，94°C 30s，53°C 30s，72°C 30s，72°C 5min，35 个循环。 反应结束后，2 %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
[0026] 本发明克服现有技术的不足，提供一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，通过 将LDR与PCR技术相结合的检测导致梅花鹿粘膜病的BVDV，具体为：首先，从NCBI中下载 BVDV全序列，通过软件比对BVDV的5 ' -UTR进行病毒特异性序列的设计，并以副猪嗜血杆菌 的引物为通用引物进行探针合成；探针包括上游探针和下游探针，上游探针从左到右依次 是上游通用引物对应序列、上游病毒特异序列，下游探针从左到右依次是下游病毒特异序 列、下游通用引物对应序列。以病毒基因组RNA反转录的cDNA为模板进行LDR、PCR扩增， 琼脂糖凝胶电泳检测。此方法的建立对鹿粘膜病病毒的流行病学调查和疫情控制具有重要 的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是本发明实施例中LDR退火温度优化后的电泳检测结果图；其中，M :2000bp Marker，泳道1?5 :退火温度依次为阴性对照，67. 2°C，68. 4°C，69. 6°C，70. 8°C ;
[0028] 图2是本发明实施例中PCR退火温度优化后的电泳检测结果图；其中，M :2000bp Marker，泳道1?6 :退火温度依次为50°C，52°C，54°C，56°C，58°C，阴性对照；
[0029] 图3是本发明实施例中LDR探针浓度和PCR引物浓度优化后的电泳检测结果图； 其中，M:DNA Marker DL2000;1:引物浓度ΙΟμΜ、探针浓度ΙΟμΜ时LDR-PCR结果；2:弓丨 物浓度1〇μΜ、探针浓度20μΜ时LDR-PCR结果；3 :引物浓度ΙΟμΜ、探针浓度50μΜ时 LDR-PCR结果；4:引物浓度20μΜ、探针浓度ΙΟμΜ时LDR-PCR结果；5 :引物浓度20μΜ、 探针浓度20 μ Μ时LDR-PCR结果；6 :引物浓度20 μ Μ、探针浓度50 μ Μ时LDR-PCR结果；7 : 引物浓度50μΜ、探针浓度ΙΟμΜ时LDR-PCR结果；8 :引物浓度50μΜ、探针浓度20μΜ时 LDR-PCR结果；9 :引物浓度50 μ Μ、探针浓度50 μ Μ时LDR-PCR结果；
[0030] 图4本发明实施例中LDR-PCR检测灵敏度结构图；其中，M :2000bp Marker，泳道 2?6模板浓度依次为104, 103, 102, 101，10°拷贝和阴性对照。
【具体实施方式】
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0032] 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)病毒株已在 文献："董航，吉林大学，硕士论文《梅花鹿粘膜病灭活疫苗的制备与免疫效果检测》"中公 开。
[0033] 主要仪器和试剂：凝胶电泳图像分析系统（SynGen，英国）；PCR仪（Bio-Rad,美 国）；超微量核酸分光光度计（Thermo,美国），Taq DNA聚合酶、pUCm-T载体购自上海生工； Taq DNA连接酶购自NEB公司；其他试剂均为国产分析纯。
[0034] 实施例1探针及引物设计
[0035] 根据GenBank中已发表的序列（具体序列登记号：JX276542. 1/GU120246. 1/ AB359932. 1/KC695810. 1/JN248734. 1/AJ304385. 1/LM994627. U JN715040. UAY363064. U KJ131535. 1、JN715018. 1、KC757383. 1、JQ994208. 1、JN967742. 1、EU224231. 1、U97455. 1、 AY363072. 1、⑶120248. 1、KF834226. 1、FJ615536. 1、FM165317. 1、DQ088995. 2、L20925. 1、 EF210349. 1、M31182. 1、FJ615532. 1、GQ495685. 1、AF417975. 1C)，应用 Primer Premier5.0 软件设计引物和LDR探针，设计好的引物和探针通过NCBI中的BLAST进行特异性鉴定，如 表1和表2所示。探针引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0036] 表1通用引物序列
[0037]
【权利要求】
1. 一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 探针的设计 根据BVDV的5' -UTR设计病毒特异性序列，以副猪嗜血杆菌的引物为通用引物序列，得 到探针，所述探针包括： 上游探针序列（5' -3'）： TTACCGGCGAGAAGAGTTGGGCATAGCGAGGGCATGCCCACAGCACATCT ； 下游探针序列（5' -3'）： TAACCTGGACGGGGGTCGCCTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT ； (2) BVDV的检测 通过上述上、下游探针以病毒基因组RNA反转录的cDNA模板进行LDR反应，得到连接 产物； 通过上述通用引物序列以所述连接产物为模板进行PCR反应，得到扩增产物，琼脂糖 凝胶电泳检测电泳产物确定BVDV。
2. 如权利要求1所述的快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，在步骤（1) 中，所述通用引物序列包括： 上游通用引物序列（5' -3'）： AATGGCCGCTCTTCTCAACCCGTATC ； 下游通用引物序列（5' -3'）： CTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT。
3. 如权利要求2所述的快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，在步骤（1) 中，所述病毒特异性序列包括： 上游病毒特异序列（5' _3'）： CGAGGGCATGCCCACAGCACATCT ； 下游病毒特异序列（5' _3'）： TAACCTGGACGGGGGTCGCC。
4. 如权利要求3所述的快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，在步骤（2) 中，所述LDR反应具体为：以BVDV的cDNA为模板，进行LDR连接反应，并对LDR反应体系和 反应参数进行优化，优化后的反应体系为：50μΜ上、下游探针各1.0yl，2U Taq DNA连接 酶（4〇υ/μ 1)，约 20ng/y 1 cDNAl. Ομ 1，10XLDR Bufferl. Ομ l，ddH20 补齐至 10μ 1，反应 条件：94°C预变性 3min，94°C变性 30s，68. 4°C 4min，10 个循环。
5. 如权利要求4所述的快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，其特征在于，在步骤 (2)中，所述PCR反应具体为：以连接产物为模板，总体积25μ1的PCR反应体系包括 lOXBuffer 2· 5μ l，25mM MgCl22. 0μ 1，上游通用引物（10μΜ)和下游通用引物（10μΜ)各 0· 5μ 1，2· 5mM dNTP2. 0μ 1，Taq DNA 聚合酶（5υ/μ 1)0. 25μ 1，LDR 连接产物 1. 0μ 1，反应 条件：941：31^11，941：3〇8,531：3〇8,721：3〇8,721：51^11，35个循环，反应结束后，2%的琼 脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
【文档编号】C12Q1/70GK104195267SQ201410456381
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】丁壮, 尹仁福, 丛彦龙, 穆昱, 周玉龙 申请人:吉林大学