一种葱鳞葡萄孢菌的快速检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物病害诊断及防治技术领域，具体涉及一种快速检测葱属类作物主 要病原菌葱鳞葡萄孢菌（Botrytissquamosa)的快速检测方法及应用。 技术背景
[0002] 葱蒜类蔬菜是具有特殊气味的一类作物，主要包括葱、大蒜、蒜薹、蒜苗、洋葱、韭 菜等。富含糖分、维生素以及多种矿物质，并具有杀菌作用，在东西方饮食文化中都占据重 要地位。然而葱蒜类蔬菜无论在田间栽培还是采后储运过程中，都容易受到病害的威胁，其 中一种最主要的真菌性病原为葱鳞葡萄孢菌，其拉丁学名为：BotrytissquamosaWalker， 该菌属半知菌亚门葡萄孢属，在葱蒜类蔬菜的主要种植产区如亚洲、欧洲、南美洲及北美洲 造成重大的经济损失。以我国的特色蔬菜蒜薹为例，在采收以后由B.squamosa引起的灰霉 病，每年可导致20-30%的损失。
[0003]B.squamosa主要侵染葱蒜类蔬菜的叶片。该菌的菌丝及分子孢子可随病残体越 冬；或以菌核形态在土壤中越冬越夏，并随种苗调运传播，当遇有较低的温度和较高的湿度 条件时即可发生和流行。该菌的分生孢子可在3-27°C范围内由菌核产生，而且一旦侵染 寄主便会大量产生分生孢子，引发二次侵染，并迅速扩展。因此，快速、准确地检测和鉴定 B.squamosa并有效控制其引起的病害，对降低葱蒜类蔬菜的经济损失至关重要。
[0004] 传统的真菌鉴定方法主要通过形态学，如菌落、分生孢子等形态来鉴定。但形态学 鉴定方法繁琐，耗时长，而且需要丰富的实践经验。随着分子生物学技术的迅速发展，分子 标记成为鉴定真菌种类的主要技术手段。在各种分子标记技术中，基于RAro结合SCAR的技 术，可以获得物种特异性的标记，其基本原理是，首先RAro利用随机引物（一般为8-10bp) 通过PCR反应随机扩增DNA片段，通过凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性，并在目的 菌种与近缘物种间进行比较，获取目的菌种所特有的扩增产物，并将其从凝胶中切割回收， 将回收的产物进行克隆并测序，进一步获得目的菌株经RAH)扩增所获的特异性产物的序 列信息，并以片段两端序列设计特异引物（>18bp)，对基因DNA片段再进行PCR特异扩增，就 能把与原RAH)片段相对应的单一位点鉴别出来。RAH)结合SCAR获得的针对特定物种的特 异性引物，对待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示，可以方便、快捷、可靠地 检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。与传统的真菌鉴定方法相比，分子标记能准确、快 速地从植物组织上附着的混合微生物群体中鉴定出特定类型的病原菌。
[0005] 对于葱鳞葡萄孢菌B.squamosa这种危害葱蒜类蔬菜作物的主要病原真菌，目前 还缺乏有效的分子标记，本发明则通过RAPD结合SCAR技术开发了B.squamosa特异性的分 子标记引物，并建立了快速、准确地鉴定B.squamosa的新方法。
【发明内容】
[0006] 本发明克服现有技术存在的问题，旨在提出一种快速、有效且容易操作的检测方 法来鉴定葱蒜类蔬菜作物的重要病原菌葱鳞葡萄孢菌（Botrytissquamosa，B.squamosa)。
[0007] 本发明提出的葱鳞葡萄孢菌的快速检测方法，所述方法主要包括以下步骤：
[0008] (1)设计检测所述葱鳞葡萄孢菌（B.squamosa)的特异性引物：
[0009] 本发明中，设计检测B.squamosa的特异性引物为：采用RAPD(Random AmplificationPolymorphicDNA,RAPD)和SCAR(Sequence-characterizedAmplified Regions)相结合的方法，开发设对能够特异性检测B.squamosa的引物，如以下SEQID Ν0· 1 和SEQIDΝ0· 2 所示：
[0010] 上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDΝ0· 1);
[0011] 下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDΝ0· 2)。
[0012] (2)提取对待检样品的总DNA;
[0013] (3)以待检样品DNA为模板，用所述葱鳞葡萄孢菌特异性引物进行PCR聚合酶链式 反应；
[0014] (4)将得到的PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳，经GoldenView染色后，在凝胶成 像系统下进行分析，以是否具有301bp的葱鳞葡萄孢菌的特异性扩增产物，判断对应的待 检样品（包括植物样品）是否受到葱鳞葡萄孢菌的侵染。
[0015] 本发明技术方案包括：设计开发特异性检测葱鳞葡萄孢菌的特异性引物，葱鳞葡 萄孢菌检测方法的建立及应用。本发明检测方法中，在一具体实施方案中包括如下步骤：
[0016] (1)设计葱鳞葡萄孢菌特异性引物：
[0017] 上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO. 1);
[0018] 下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDΝ0· 2)。
[0019] (2)CTAB法提取待测样品的DNA
[0020] a)取幼嫩菌丝0. 05g于研钵中，充分研磨破碎后，加入提前预热的lmLCTAB提取 液，再将混合液转入2mLEP管中，65°C水浴处理lh;
[0021] b)向EP管中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比25:24:1)，震荡混匀后， 12000rpm离心 10min;
[0022] c)取上清液于新的EP管中，依次加入等体积的异丙醇溶液和1/10体积的NaAc， 轻轻上下颠倒，_20°C沉淀30min;
[0023] (1) 12000印111离心1〇111；[11，小心倒去上清液留沉淀，再加入5001]11^75%的乙醇清洗 沉淀；
[0024] e) 12000rpm离心5min，倒去上清，室温瞭干沉淀；
[0025] f)加入20_30uL无菌水溶解DNA, _20°C保存备用。
[0026] CTAB提取液配方（1L):CTAB20g;NaCl81.82g;lMTris-Hcl(pH8.0)100mL; 0. 5MEDTA(pH8. 0)40mL，蒸馏水定容至 1L。
[0027] (3)?〇?扩增：反应体系2(^1，包括商品化的2\1^11(^了39?〇?11^1(^1，0嫩 10-20ng，上下游引物各0. 5μ1，ddH20补齐值20μ1。PCR扩增条件为：第一循环94°C预变 性5min;第二循环94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸30sec，共30个循环；第三循 环72°C终延伸7min。
[0028] (4)?0?产物6以1，2%琼脂糖凝胶电泳，电压90￥，4〇1^11，凝胶成像仪观察并拍照， 在301bp处出现条带，贝lj说明该病原菌为B.squamosa。
[0029] 本发明还提出了一对用于特异性检测葱鳞葡萄孢菌的引物，所述引物如以下SEQ IDΝα1 和SEQIDΝα2 所示：
[0030]上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO.1);
[0031]下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDNO. 2)。
[0032] 本发明主要提出了用于特异性检测葱鳞葡萄孢菌的检测试剂盒，所述试剂盒包含 如以下SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 2所示的引物：
[0033]上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO.1);
[0034]下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDNO. 2)。
[0035] 所述试剂盒还进一步包括：
[0036]PCR反应体系；其中，所述PCR反应体系20μ1包括：2XTiandzTaqPCRmix 10μ1，待测样品的DNA10-20ng，上下游引物各0. 5μ1，ddH20补齐至20μ1。
[0037] 所述试剂盒还进一步包含：CTAB提取DNA缓冲液、酚-氯仿-异戊醇（体积比 25:24:1)、异丙醇、NaAc溶液，乙醇溶液（75% )。
[0038] 本发明还提出了将所述检测方法应用于对葱属类蔬菜作物主要病原菌葱鳞葡萄 孢菌快速检测诊断中。
[0039] 本发明有益效果包括：利用一对特异性PCR引物，通过基本的PCR操作，利用PCR 扩增产物的有无，鉴定侵染葱属类致病菌B.squamosa，相比于对待测样品进行病原菌的分 离、纯化、鉴定的现有传统方法相比，本发明提供的快速、简便检测B.squamosa方法的优点 包括：（1)周期短：传统方法从对病原菌的分离纯化和培养，到对病原菌生物学特性的分析 鉴定，至少需要耗时3~7天，而本方法从DNA提取，到PCR和电泳检测，可在1天之内完 成。（2)简便易行：用传统方法进行葱鳞葡萄孢菌鉴定，需要工作人员具备非常特殊的植物 病理学、微生物培养和形态学分析等方面的专业知识，且步骤繁琐，而本方法仅需具备普通 的分子生物学技术基础就可以完成鉴定工作。（3)鉴定结果客观可靠：