纳米粒子的nmr食源性致病菌快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种致病菌的快速检测方法，尤其涉及一种基于CoFe204纳米粒子的NMR食源性致病菌快速检测方法。
【背景技术】
[0002]基本原理:单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。CoFe204纳米粒子为抗体修饰改性的CoFe 204纳米粒子，CoFe 204由于具有元素Co,具有高饱和磁化强度，在粒径小到一定程度时，会出现超顺磁特性。因此，其粒子对周围水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫时间的影响非常大。这也就是这类物质作为造影剂的机理。非常微量的纳米CoFe204就会造成水的核磁共振自旋-晶格弛豫时间大幅下降，通过空白对照就能明确，是由于存在这种物质引起的。因此可以构建CoFe204纳米粒子生物传感器，从磁共振的角度来做检测。
[0003]其主要的原理步骤:(1)检测目标菌的特异性CoFe204纳米粒子的制备。从市场上购买CoFe204纳米材料，也可以通过其他化学合成方法制备纳米级的CoFe 204。使用娃烧偶联剂或PEG(聚乙二醇)，修饰提高生物相容性，其通式为:Y(CH2)nSiX3。此处，η为0_3 ;Χ为可水解的基团；Υ为有机官能团。X通常是氣基、甲氧基、乙氧基、乙醜氧基等，这些基团水解时即生成硅醇(Si (0Η)3)，而与无机物质结合，形成硅氧烷。Υ是乙烯基、氨基、环氧基、甲基丙烯酰氧基、巯基。这些反应基团可与有机物质反应而结合。因此，通过使用硅烷偶联剂，可在无机物质和有机物质的界面之间架起“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接在一起提高复合材料的性能和增加粘接强度的作用。再通过修饰特异性抗体可实现表面功能化，形成特异性粒子，再封闭多余的活性位点。(2)采用常规方法将待检目标菌的特异性单抗固定在酶标板表面，并将多余活性位点封闭，备用。(3)将待检样品加到第(2)步制得的固定了目标菌单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在目标菌，则目标菌会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标菌被固定在酶标板上。(4 )将第(1)步所制的抗体修饰的CoFe204纳米粒子加入第3)步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标菌，通过粒子的特异性反应，则粒子会与酶标板上的目标菌发生特异性结合，形成双抗夹心结构，此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合的粒子洗去。在酶标板上剩下的就只有结合目标菌的粒子。若酶标板上没有目标菌，则所以粒子都被洗去。(5)加入定量的洗脱液(30%甲醇)将酶标板上的结合了目标菌的粒子洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(CuteNMR，宁波健信公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有粒子存在，从而说明样本中有目标菌，粒子的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明粒子越多，从而间接说明目标菌越多，通过加标验证定量检测样本中目标菌的数目。
[0004]该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间，核磁共振检测只需几分钟。所有的食品标准，致病菌都不得检出。因此，用该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。
【发明内容】
[0005]—种基于CoFe204纳米粒子的NMR食源性致病菌快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价。该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。
[0006]—种基于CoFe204纳米粒子的NMR食源性致病菌快速检测方法，核磁共振仪对顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与CoFe204纳米粒子含量的相关性指标。
[0007]该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特异性CoFe204纳米粒子的分离，从核磁共振弛豫时间变化的角度，检测出样品中的有害致病菌。由于核磁共振仪自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率对CoFe204纳米粒子非常敏感，即在去离子水中，存在微量的CoFe204纳米粒子，则水的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫就会显著下降。通过定量检测出样品中的免疫粒子含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与粒子含量线性相关，拟合度较好。最终以免疫粒子与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。所有的食品标准，致病菌均不得检出。因此，该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。
[0008]本发明是这样实现的，步骤如下。
[0009](1)检测目标菌的特异性CoFe204纳米粒子的制备。
[0010](2)将目标菌特异性单抗固定在酶标板表面，病封闭多余活性位点。
[0011](3)将待检样品加到第(2)步制得的固定了目标菌单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在目标菌，则目标菌会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标菌被固定在酶标板上。
[0012]( 4 )将第(1)步所制的抗体修饰的CoFe204纳米粒子加入第(3)步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标菌，通过粒子的特异性反应，则粒子会与酶标板上的目标菌发生特异性结合，形成双抗夹心结构，此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合的粒子洗去。在酶标板上剩下的就只有结合目标菌的粒子。若酶标板上没有目标菌，则所以粒子都被洗去。
[0013]( 5 )加入定量的洗脱液(30%甲醇)将酶标板上的结合了目标菌的粒子洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(CuteNMR，宁波健信公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有粒子存在，从而说明样本中有目标菌，粒子的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明粒子越多，从而间接说明目标菌越多，通过加标验证定量检测样本中目标菌的数目。
[0014]所述粒子为具有顺磁特性的CoFe204纳米材料，纳米粒径小于500纳米。
[0015]所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振弛豫时间的变化。
[0016]所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间。
[0017]本发明的有益效果:本发明提供一种客观的快速检测出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依赖于建立的可用于检测CoFe204纳米粒子的核磁共振检测方法。该方法可以客观有效地对食品中有害致病菌进行检测，相比于致病菌的生物培养确认，该方法具有快速检测的优势，可以用于大规模样本的快速筛选。
【具体实施方式】
[0018]本发明将通过以下实施例作进一步说明。
[0019]实施例1。
[0020]检验食品样本测定其是否含有有害致病菌一一单增李斯特菌。
[0021]l、CoFe204纳米粒子制备:CoFe 204纳米粒子可以从市场购买，也可以参考文献用化学方法合成。将得到的CoFe204与PEG-1500按质量比1:10在无水乙醇的溶解下，加入反应釜中，密封完毕后放入烘箱中，将温度调至90°C，反应12小时；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min ;将洗涤好的最终产品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修饰的CoFe204纳米粒子。
[0022]抗体修饰:称取一定量的羧基修饰的CoFe204纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各lmL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。)将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入过量的单增李斯特菌抗体，在混匀仪上偶联lh。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，