一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及基于环介导恒温扩增技术检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性基因型G143A菌株的方法及引物组合物；可用于灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性群体发展的动态监测与抗性风险评估，为作物灰霉病的抗性预警、抗性治理及合理用药提供科学指导。
【背景技术】
[0002]由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病，是一种重要的世界性病害。该病害寄主广泛，可侵染235余种植物，在我国各地均有发生，它不仅侵染果实，也侵染茎、叶、花，还会引起大棚蔬菜上的果实腐烂，可造成产量损失20-30%，局部减产达到70%以上，严重时甚至是绝收，从而造成严重的经济损失。由于缺少有效的抗灰霉病品种，灰葡萄孢菌寄主专化性弱、产孢量大、传播速度快、极易产生遗传变异性，因此，目前灰霉病的防治仍以化学防治为主。该方法见效快，防效高，操作简便，能有效的减少灰霉病的发生与发展，降低经济损失，成为防控该病害的关键措施之一。但是随着单一杀菌剂使用年限的增长、药剂使用不规范及药剂剂量的增大，田间抗性菌株也不断出现，且呈现出逐年增加的趋势。根据国内外研究报道，灰葡萄孢菌已对很多常用杀菌剂产生了抗性，如苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、苯胺基嘧啶类、N-苯基氨基甲酸酯类、甲氧基丙烯酸酯类(QoIs)和琥珀酸脱氢酶类(SDHIs)等杀菌剂。随着灰霉病抗性问题日益突出，灰霉病的抗药性监测对抗性流行性预警及田间合理用药具有重要指导作用。检测或监测灰葡萄孢菌对杀菌剂的抗药性，通常是通过单孢分离菌株后采用菌丝生长法、孢子萌发法及微孔板法，然而这些传统的检测方法检测周期较长，从分离到鉴定长达I周，检测效率低，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染，给实验结果带来误差；同时，还需投入大量的人力资源，增加检测成本。
[0003]近年来，随着核酸相关分子检测技术的发展，PCR技术为植物病原菌的抗药性检测提供了快速、灵敏、准确的优势，但是检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的电泳过程，检测时间长，检测成本高昂等，不能满足经济高效检测的需求，并且在鉴定过程中还需要接触大量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患。因此，开发对植物病原菌抗药性检测的新技术已迫在眉睫。
[0004]环介导恒温扩增反应(LAMP)是日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是:利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60?65°C范围30-80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪、凝胶成像系统等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在I小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原突变基因型的快速鉴定及检测。
[0005]已有研究表明，细胞色素b(cyt b)第143位是大多数病原体Qo抑制剂的一个结合位点。由于灰葡萄孢菌cty b基因存在结构多样性，在第143/144位氨基酸之间有内含子插入，也有无内含子插入的结构。其中，敏感菌株在这两种结构中均存在，抗性菌株仅出现在第143/144位氨基酸之间均没有内含子插入的结构中。在灰葡萄孢菌中，其对QoI类杀菌剂的抗性主要是通过对病原菌进行单基因突变，将cyt b基因第143位甘氨酸(G)变为丙氨酸(A)后，使得对QoI类杀菌剂表现出高抗。目前，这也是在灰葡萄孢菌中报道的唯一的QoI类杀菌剂抗性基因型。
[0006]本发明中，依据灰葡萄孢菌cyt b基因第143位氨基酸突变基因型(GGT — GCT)，基于环介导恒温扩增技术(LAMP)建立了灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的快速分子检测技术。该检测技术具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对灰霉病的抗药性检测、抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP快速分子检测的相关报道。
【发明内容】
[0007]发明目的:针对已有灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性鉴定方法中存在费时、费力、成本高、准确性低等缺点及PCR检测技术需要昂贵的热循环仪器和繁琐的电泳操作过程，无法达到快速检测的需要。本发明的目的是提供一种灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测引物组合物及基于LAMP技术提供一种快速分子检测方法，该方法具有检测周期短、准确性和灵敏度高、肉眼可以直接观察检测结果等诸多优点。
[0008]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
[0009]一种用于检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测引物组合物:有正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成；各引物序列具体如下:
[0010]FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；
[0011 ] BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTTAATGGCA-3’ ；
[0012]F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；
[0013]B3:5 ’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
[0014]所述的LAMP检测引物组合物在检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性中的应用。
[0015]一种检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测试剂盒:包括ImL检测溶液，所述的检测溶液包括:1.2μΜ正向内引物FIP，1.2μΜ反向内引物ΒΙΡ，0.3μΜ正向外引物 F3，0.3 μΜ 反向外引物 B3，60 yL 1XThermoPol Buffer, 1.5mM MgCl2,1.0mM dNTPs，
0.2M甜菜碱，1.5mM羟基溴酚蓝(HNB)，160U Bst DNA聚合酶，加入无菌超纯水制备得到；其中，各引物序列如下:
[0016]FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；
[0017]BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’ ；
[0018]F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；
[0019]B3:5 ’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
[0020]所述的灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测试剂盒在检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性中的应用。
[0021]一种检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测方法:包括提取待检灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下观察结果，若存在梯状条带，则证明所检测的灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂抗性菌株；若无梯状条带，则证明所检测灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂敏感菌株；或观察LAMP反应溶液颜色变化，若为天蓝色，判定为QoI类杀菌剂抗性菌株；若为紫色，判定为QoI类杀菌剂敏感菌株。
[0022]所述的检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测方法:提取待检灰葡萄孢菌的DNA，取I μ L DNA溶液，加入9 μ L试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应参数为59-610C 60min，80°C 1min0
[0023]本发明的检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测方法，包括提取待检灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP ;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下观察结果(羟基溴酚蓝不会影响电泳结果)，若存在梯状条带，所检测的灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂抗性菌株；若无梯状条带，则证明所检测灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂敏感菌株。羟基溴酚蓝(HNB)是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与LAMP