植物病原菌形态学 鉴定和诊断的传统方法需要依赖于鉴定人员对病原微生物形态学知识积累的主观经验，而 本发明检测方法针对葱鳞葡萄孢菌所开发的分子标记，则依赖于物种间DNA的差异和PCR 扩增的多态性，仅需按照标准的流程操作，以扩增产物的有无来特异性区分该病原菌与其 它病原菌，对结果的判定客观、高效、可靠。
【附图说明】
[0040] 图1表示葱鳞葡萄孢菌B. squamosa特异性引物在已知种型的菌株PCR鉴定结 果。其中：M :D2000marker ;1-31泳道为灰霉菌属真菌：0022、0023、0024、0025、0026、0027、 0050、0051、0060、0061、0080、0081、0094、0111、0128、0158、0160、0163、0164、0165、0166、 0167、0168、0174、0175、0198、0205、0239、0361、0364、0510 ;32-33泳道为葱鳞葡萄孢菌 EXGL-9、Bc-2 ;34-42泳道分别为：Bc-38、Bc-30、Bcp-72、EX0L-l、PH-l、0112、Alt、Col、H20。
[0041] 图2表示葱鳞葡萄孢菌B.squamosa特异性引物在洋葱组织中的检测结果，葱鳞葡 萄孢菌侵染洋葱后PCR鉴定结果。其中：M:50bpmarker;泳道1为B.squamosa基因组DNA; 泳道2为洋葱病组织基因组DNA;泳道3为健康洋葱组织基因组DNA。
【具体实施方式】
[0042] 结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容 不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变 化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、 条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识， 本发明没有特别限制内容。
[0043] 实施例1 :已知菌种的菌株的PCR鉴定结果
[0044] 1、菌株的DNA提取
[0045] 实验所用菌株如表1所示，其中包含一株葱鳞葡萄孢（Botrytissquamosa， EXGL-9)，分离自葡萄、草莓、前子、番前、生菜等寄主的葡萄孢属（Botrytissp.)的病原真 菌，由华中农业大学李国庆教授馈赠的大葱盲种葡萄孢菌（Botrytisporri，Bc-38)、拟蚕 豆葡萄抱菌（Botrytisfabiopsis，Bc_30)、中国葱葡萄抱菌（Botrytissinoallii，Bc_72) 菌株，以及镰刀菌属、链格孢属、炭疽菌属的菌株（PH-U0112、Alt、Col)。各菌株接种在铺 有玻璃纸的PDA培养基上，25 °C生长1天，挑取各菌株菌丝，采用CTAB法提取DNA备用。
[0046] 2、特异引物的合成
[0047] 上游引物：5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO. 1);
[0048] 下游引物：5' -CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDΝ0· 2)。
[0049] 3、PCR反应体系及扩增程序
[0050] 反应体系为20μ1，包括商品化的2XTiandzTaqmastermix(2XTiandzTaqPCR mix)10μl，特异性上下游引物SEQIDNαl和SEQIDNα2各0·5μl，DNA10-20ng，ddH20 补齐至20μ1。
[0051] 扩增程序为：第一循环94°C预变性5min;第二循环94°C变性3〇sec，60°C退火 30sec，72°C延伸30sec，共30个循环；第三循环72°C终止延伸7min。PCR产物4°C保存。
[0052] 4、PCR产物的鉴定
[0053] PCR产物6μ1，经1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，电压90V，时间40min，凝胶成像仪观察 并拍照。
[0054] 5、实验结果
[0055] 利用本发明的特异性引物，以已知种型的菌株为模板，PCR扩增结果如图1所 示，1-31和34-37泳道为灰霉属真菌、38-41为其它属的PH-1(Fusariumgraminearum)、 0112(Fusariumoxysporum)、Alt(Alterariatenuissima)、Col(Colletotrichumsp.)菌 株，均不能扩增出条带，32、33泳道为B.squamosa可以在301bp处扩增出结果，且与已知结 果相符。
[0056] 本实施例中，检测方法中所用的试剂盒包括：CTAB提取DNA缓冲液、酚-氯仿-异 戊醇（体积比25:24:1)、异丙醇、NaAc溶液，乙醇溶液（75% )、商品化PCRMix。
[0057] 实施例2 :发病洋葱组织的PCR扩增结果
[0058] 1、植物病组织中真菌DNA的提取
[0059] 本发明提取B.squamosa侵染的洋葱组织内真菌基因组DNA。
[0060] PCR扩增体系、程序、特异引物及合成，同实施例1。
[0061] 2、实施结果
[0062] 利用本发明的特异性引物，以B.squamosa侵染的洋葱病组织基因组DNA为模板， PCR扩增结果如图2,泳道1为B.squamosa真菌基因组DNA，可以在301bp处扩增出条带； 泳道2为洋葱病组织基因组DNA，也可在301bp处扩增出条带；泳道3为健康洋葱组织DNA， 其不能扩增出条带。结果表明本发明提供的特异性引物和技术方案可有效的检测洋葱组织 中是否存在B.squamosa侵染。
[0063] 本实施例中，检测方法中所用的试剂盒包括：CTAB提取DNA缓冲液、酚-氯仿-异 戊醇（体积比25:24:1)、异丙醇、NaAc溶液，乙醇溶液（75% )、商品化PCRMix。
[0064] 表1供试菌株种类与来源
[0065]
【主权项】
1. 一种葱鳞葡萄孢菌的快速检测方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤： (1) 设计检测所述葱鳞葡萄孢菌的特异性引物为：采用RAPD和SCAR相结合的方法，设 计一对能够特异性检测的引物，所述引物如以下SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示： 上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO. 1); 下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDN0.2); (2) 提取对待检样品的总DNA; (3) 以待检样品DNA为模板，用所述葱鳞葡萄孢菌特异性引物进行PCR聚合酶链式反 应； (4) 将得到的PCR产物经2 %琼脂糖凝胶电泳，经GoldenView染色后，在凝胶成像系统 下进行分析，以是否具有301bp的葱鳞葡萄孢菌的特异性扩增产物，判断对应的待检样品 是否受到葱鳞葡萄孢菌的侵染。2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（3)中，所述PCR反应体系 包括：2XTiandzTaqPCRmix10yl，DNA10-20ng，上下游引物各 0·5μ1，ddH20 补齐至 20μ1〇3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（3)中，所述PCR扩增条件为： 第一循环94°C预变性5min;第二循环94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸30sec，共 30个循环；第三循环72°C终止延伸7min。4. 一对用于特异性检测葱鳞葡萄孢菌的引物，其特征在于， 所述引物如以下SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示： 上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO. 1); 下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDN0.2)。5. -种用于特异性检测葱鳞葡萄孢菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如以下 SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2 所示的引物： 上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO. 1); 下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDN0.2)。6. 如权利要求1所述的检测方法在葱鳞葡萄孢菌的鉴别或葱蒜类蔬菜作物的田间和 采后灰霉病的诊断和预警中的应用。
【专利摘要】本发明建立了一种针对葱鳞葡萄孢菌进行快速检测的特异性分子标记引物和检测方法，该方法通过PCR反应能特异性扩增出属于葱鳞葡萄孢菌的特征性产物，大小为301bp。本发明适用于从田间到采后的各个环节，能够实现对葱蒜类蔬菜的主要病害——葱鳞葡萄孢菌进行快速可靠的诊断和鉴定，为葱蒜类蔬菜的病害预警、防治，并为该类作物采后的安全贮运提供保障。本发明还提出了一种包含所述用于快速检测葱鳞葡萄孢菌的特异性分子标记引物的试剂盒，以及将所述检测方法用于葱鳞葡萄孢菌的鉴别或葱蒜类蔬菜作物的田间和采后灰霉病的诊断和预警中的应用。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N15/11, C12R1/01, C12Q1/68
【公开号】CN105296629
【申请号】CN201510741165
【发明人】朱品宽, 刘丽影, 许玲
【申请人】华东师范大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月3日