肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种肠道微生物宏基因特征在作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛 选标志物中的用途。
【背景技术】
[0002] 目前2型糖尿病治疗领域并没有药物疗效判断，以及治疗前的分型诊断。根据2 型糖尿病的病理生理机制，主要为胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷。虽然2型糖尿病治疗领 域内分别有针对胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷的药物，但是对于患者本身以胰岛素抵抗还 是分泌缺陷为主的分型诊断并没有科学简便可行的方法。
[0003] 现有临床上有可行性的方案是，测量患者BMI，腰围和胰岛素水平。BMI，腰围超过 中国人标准，或者通过患者空腹血糖和胰岛素水平计算H0MAIR值即可判断其存在胰岛素 抵抗。而胰岛素水平并无国际或国内通用标准，一般以患者血糖和胰岛素计算得ΗΟΜΑβ指 数来代表，但无法做为判断胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷的程度的指标，因此无法满足精 准医疗的要求。
[0004] 临床上目前能够精确评判胰岛素抵抗和β细胞功能的实验为葡萄糖钳夹实验。 评判胰岛素抵抗水平运用正糖高胰岛素水平的葡萄糖钳夹实验，而β细胞胰岛素分泌功 能运用高葡萄糖水平的钳夹实验。这两种方法历时长，患者需卧床4-5个小时，需名有经验 的医护人员操作，对患者进行多点采血，实时监测血糖，同时测定胰岛素水平。代价高昂，患 者依从性差，不易在临床开展。
[0005] 所谓精准医学把临床个体化诊疗的诉求提到了一个新的高度。肿瘤靶向药物已经 应用到临床。然而，迄今并未找到一个2型糖尿病靶向治疗的有效方案。2型糖尿病的治疗 方案繁多，患者反应不一，是导致2型糖尿病的血糖控制率低下的一个原因。针对2型糖尿 病主要发病机制，胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗的药物种类不可谓不多，但是患者本身以 胰岛素抵抗为主，还是胰岛素分泌缺陷为主并没有简单确切的临床诊断方法。
[0006]目前的研究把肝脏、脂肪（胰岛素抵抗）和胰岛β细胞（胰岛功能）做为参 与2型糖尿病发病的主要器官。而最近肠道微生物群落以及肠道粘膜上皮吸收，屏障以 及内分泌功能的病理生理在2型糖尿病的发病机制以及治疗策略中的地位越来越受到重 视。比如肠道菌群宏基因组研究发现，肠道菌群在2型糖尿病患者和正常患者中有显著 差异[Qin，J.，etal. ,Ametagenome-wideassociationstudyofgutmicrobiotain type2diabetes.Nature, 2012.]而肠道改道的减肥手术除了减轻肥胖患者的体重，出乎意 料得可使得肥胖型2型糖尿病患者的血糖在术后脱离药物治疗也能得到良好的控制，甚至 达到彻底治愈[Carlsson，L.M.S·，etal·，BariatricSurgeryandPreventionofType 2DiabetesinSwedishObeseSubjects.NewEnglandJournalofMedicine, 2012. 367 (8):p.695-704,Schauer,P.R. ,etal. ,Bariatricsurgeryversusintensivemedical therapyfordiabetes-3-yearoutcomes.NEnglJMed, 2014. 370(21):p. 2002-13]。而 模拟肠道激素作用的药物，比如GLP-1激动剂以及DPPIV抑制剂等也已成为世界范围内处 方量最大的口服降糖药物，并有不少相关心血管的受益。
[0007] 肠型[Arumugam,M. ,etal. ,Enterotypesofthehumangutmicrobiome. Nature, 2011. 473 (7346) :p. 174-80]的概念被PeerBork首次提出，意即肠道寄生菌组成 成分在人群中有比较固定的模式。人群中大概可以分成2-3类，随着样本的增多和测序技 术的提高，尤其是二代测序的推广，目前的肠型分型为2类，一个普氏菌属为主的普氏肠 型，一个是拟杆菌属为主的拟杆肠型。目前看来肠型和人体的各种医疗健康指标并未找到 直接相关的证据，相应的基因功能研究提示不同肠型代谢维生素的能力有差异，且与宿主 荤素饮食习惯有关。然而，虽然肠道寄生菌群也被认为是参与药物在人体内代谢的一个 重要媒介[Haiser，H.J.andP.J.Turnbaugh,Isittimeforametagenomicbasisof therapeutics?Science, 2012. 336(6086) :p. 1253-5],目前无临床试验证据可以证明。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于针对上述现有技术存在的肠型和人体的各种医疗健康指标缺 少直接相关的证据的缺陷，提供了肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标 志；具体提供了一种肠道微生物宏基因特征在作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志物中 的用途。本发明首次发现具有不同肠道寄生菌群的2型糖尿病患者，对糖尿病降糖药物，阿 卡波糖的治疗反应差别显著，因而，以拟杆菌属为主的拟杆肠型可作为2型糖尿病患者阿 卡波糖疗效筛选标志。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0010] 本发明涉及一种肠道微生物宏基因特征在作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标 志物中的用途，所述肠道微生物宏基因特征为拟杆菌属肠型。
[0011] 优选的，所述拟杆菌属肠型是通过对离体粪便中的寄生菌的DNA进行测序或PCR 扩增来确定的。
[0012] 优选的，所述PCR扩增具体包括：提取离体粪便中寄生菌DNA，针对特异富集的菌 属，进行16SrnaPCR扩增。
[0013] 优选的，所述拟杆菌属肠型是通过检测离体血液样本中的次级胆汁酸来确定的。 所述次级胆汁酸包括UDCA、TUDCA、GUDCA、DCA、TDCA、⑶CA、LCA、TLCA、GLCA。在本发明研究 的对象中，主要发现两种肠型一个普氏菌为主的普氏肠型，一个是拟杆菌为主的拟杆肠型。 在拟杆肠型中，次级胆汁酸中的脱氧胆酸和石胆酸水平显著低于普氏肠型，而有保护作用 的熊脱氧胆酸则高于普氏肠型。进一步肠道宏基因组分析，也发现熊去氧胆酸进一步降解 成石胆酸的K0明显在普氏肠型中富集。说明两种肠型的患者，其肠道菌群代谢胆汁酸的能 力有显著差异。
[0014] 优选的，所述次级胆汁酸的检测包括如下步骤：
[0015]S1、样品预处理：每75μL血液样品，加入300μL含内标甲醇，提取目标化合物并 沉淀蛋白，涡旋、离心，吸取上清，冻干，用50μL含25 % (体积）乙腈水溶液复溶，等待进 样；
[0016]S2、检测：采用1290Infinity液相及6460Α三重四级杆质谱联用系统用于样品分 析；
[0017] 液相分离采用 100mmX2. 1mmACQUITYUPLCC8 色谱柱，粒径L7μL?，Α相为 10mM NH4HC03水溶液，B相为纯乙腈；初始时25% (体积）B相，保持0. 5分钟，随后在12. 5分钟 内线性升高到40% (体积）B相，接着，在lmin内升高到90% (体积）B相，并冲洗系统3 分钟，在0. 5分钟恢复到25 % (体积）B相，平衡2. 5分钟，流速为0. 35ml/min，柱温35°C， 进样体积5μL;
[0018] 质谱采用ESI源负离子模式检测，主要参数如下：GasTemp:350°C;Gas Flow:81/min；Nebulizer:40psi；SheathGasTemp:400°C；SheathGasFlow:81/min； Capillary:3500V；Nozzlevoltage:400V〇
[0019] 优选的，拟杆菌属肠型的2型糖尿病患者阿卡波糖疗效包括降糖外改善胰岛素抵 抗、降低次级胆汁酸、促进心血管风险降低。
[0020] 优选的，所述降低有害次级胆汁酸的指标包括：GDCA，TDCA，TLCA，降低牛磺酸结合 胆汁酸指标包括，TCA，TDCA，TLCA，TUDCA。
[0021] 优选的，所述改善胰岛素抵抗的指标包括空腹血糖下降，空腹C肽和胰岛素水平 的下降，腰臀比下调，Η0ΜΑ胰岛素抵抗指数下调，Adiponectin上调。
[0022] 优选的，所述促进心血管风险降低的指标包括TOGFAA、TOGFAABB、内皮素、VegfC 血浆因子的下降。
[0023] 本发明还涉及一种用于2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选的试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0024] 收集离体粪便样品或离体血液样品的试剂；
[0025] 对离体粪便样