糖尿病生物标记物的制作方法

糖尿病生物标记物的制作方法
【专利摘要】本发明已根据CD4初始(CD45RO-CD62L+)与中枢记忆(CD45RO+CD62L+)的比率和CD4中枢记忆T细胞亚群的水平而发现一种新的1型糖尿病中自身胰岛素产生下降的标记物。一种在受试者中诊断自身免疫和其进行性，更确切来说诊断糖尿病、前糖尿病、对糖尿病的易感性或疗法/干预模态对一种或多种这些病状的有效性水平的方法，所述方法可以通过以下方式进行：通过对从受试者提取的样品进行免疫荧光分析确定CD4初始(CD45RO-CD62L+)T细胞的水平；通过对从受试者提取的样品进行免疫荧光分析确定CD4中枢记忆(CD45RO+CD62L+)T细胞的水平；以及定量地关联所述CD4初始T细胞和中枢记忆T细胞的所述水平，其中CD4初始T细胞与CD4中枢记忆T细胞的低比率和/或高CD4中枢记忆T细胞表明自身免疫、对自身免疫的易感性、糖尿病、前糖尿病、对糖尿病的易感性或治疗对一种或多种这些病状的无效性。
【专利说明】糖尿病生物标记物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年5月24日提交的美国临时申请号61/651，144的优先权，所述 美国临时申请以全文引用方式并入本文。

【技术领域】
[0003] 本发明一般来讲涉及自身免疫、糖尿病领域，并且更具体来说，涉及1型糖尿病和 免疫标记物。

【背景技术】
[0004] 1型糖尿病（TlDM)最常见的形式是免疫介导的疾病，其中的胰岛素分泌β细胞被 自身免疫应答破坏。若干遗传和环境因素都与所述疾病的发病相关，这涉及到特异性靶向 胰岛素分泌β细胞的免疫细胞对胰岛的进行性炎性浸润。这种病变在临床发病前（前糖 尿病）的一段不确定时间（几个月到几年）形成并且在患者被诊断患有所述疾病之后继续 发展。
[0005] 目前有一种方法使用抗体筛选和诊断T1DM。只要所述特异性抗体存在，随着时间 的过去，显性糖尿病往往就会发展。GAD65自身抗体（GAA)、ICA512自身抗体（ICA512AA) 或抗胰岛素自身抗体（IAA)中一种或多种的表达与发展TlDM的风险相关。GAD65自身 抗体（GAA)、ICA512自身抗体（ICA512AA)或抗胰岛素自身抗体（IAA)中两种或两种以 上的表达与发展TlDM的高风险相关。（Liping Yu等，Diabetes 2001年8月，第50卷， 第 8 期，1735-1740 ;Verge CF 等，Diabetes 45:926-933, 199 ;Verge CR 等，Diabetes 47:1857-1866, 1998 和 Bingley PJ 等，Diabetes 43:1304-1310,1994)。
[0006] 然而，这种筛选对于个体患者来说用处有限。虽然抗体筛选能够检测TlDM风险的 增加水平，但是所述风险是基于总的群体并且不能告知个体患者疾病是否会在例如接下来 几个月发病或者所述个体是否可能会在接下来5至10年不患糖尿病。自身免疫破坏的强 度因不同患者而异。因此，需要一种会告知个体发展TlDM的个人风险并且能够指出疾病发 病的时间范围的诊断方法。
[0007] 还需要改善分析TlDM自身免疫治疗的主要终点。治疗要从FDA得到管理批准，临 床试验必须在合适的主要终点显示统计上显著的影响。这种治疗效果优选表现一些显而易 见和临床上显著的益处。在预防TlDM的治疗的情况下，临床疾病的延迟或不发展（这使这 些试验长达5或10年）。在干预患有临床疾病的患者的情况下，合适的主要终点与代谢控 制和糖尿病并发症相关。最常应用而代谢主要终点-未达到治愈-是自身胰岛素产生的 测量（刺激的C肽作为保留β-细胞功能的替代标记物），其它的是HbAlc和胰岛素使用。 TlDM患者中β -细胞功能的改善能够预测更好的短期和长期临床结果，这可能花费几年来 评估。对于TlDM和并发症的治疗，可以直接监测血糖水平并且可以通过糖基化血红蛋白 (例如HbAlc)的水平监测改善的血糖控制，这已经证明与短期和长期糖尿病并发症相关。
[0008] 对于希望在疾病的后临床阶段中维持β细胞功能的治疗来说，已经使用刺激的C 肽浓度来测量TlDM的发展（Palmer JP等，Diabetes2004;53:250-264)。然而，使用C肽浓 度需要长期进行重复的侵入性检测（所谓的混合餐耐量试验），因此所述试验持续很长时 间以允许评估降低β-细胞功能并且因此降低C肽浓度的疾病的发展。
[0009] 因此，需要更好的标记物作为试验的主要终点（预防和干预试验两者）以及需要 更好的标记物以便能够更迅速和可靠地指出TlDM自身免疫的进行性，从而分出前糖尿病 和糖尿病病状的阶段。还需要更好的分析法以便能够测量治疗TlDM的疗法的有效性和/ 或检测并发症。


【发明内容】

[0010] 已根据CD4初始（CD45RO-CD62L+) T细胞亚群与中枢记忆（CD45RO+CD62L+) T细胞 亚群的比率和在中枢记忆（⑶45RO+⑶62L+)T细胞亚群水平而发现一种新的1型糖尿病中 自身胰岛素产生下降的标记物。在受试者中诊断糖尿病、前糖尿病、对糖尿病的易感性或疗 法对一种或多种这些病状的有效性的方法可以通过如下方式进行：通过对从患者提取的样 品进行免疫荧光分析确定⑶4初始（⑶45RO-⑶62L+) T细胞的水平；通过对从患者提取的样 品进行免疫荧光分析确定CD4中枢记忆（CD45RO+CD62L+)T细胞的水平，以及定量地关联所 述⑶4初始T细胞和⑶4中枢记忆T细胞的水平，其中⑶4初始T细胞与⑶4中枢记忆T 细胞的低的或降低的比率，或高的或增加的CD4中枢记忆T细胞水平表明自身免疫疾病、前 自身免疫疾病、对自身免疫的易感性或治疗对一种或多种这些病状的无效性。在前糖尿病 情形中，TlDM特异性自身抗体的存在表明TlDM自身免疫本身的存在。因此，在本发明的一 个方面中，本文中描述的方法与确定是否存在糖尿病自身抗体组合使用。
[0011] 在本发明的一个方面中，公开了在受试者中确定疗法对糖尿病和前糖尿病病状的 有效性的方法，所述方法包括以下步骤：在受试者中开始疗法，从所述受试者提取样品，在 所述样品中测量⑶4 T细胞初始（⑶45RO-⑶62L+)亚群与中枢记忆（⑶45RO+⑶62L+)亚群 的比率和/或CD4中枢记忆T细胞的水平，以及评估所述疗法的有效性，其中在所述疗法期 间比率的增加和/或低的/下降的CD4中枢记忆T细胞表明治疗有效。
[0012] 在其它实施方案中，所述方法可以包括在所述受试者中开始疗法，从所述受试者 提取样品，测量所述样品中的⑶4 T细胞中枢记忆（⑶45RO+⑶62L+)亚群，以及评估所述疗 法的有效性，其中在所述疗法期间低的或降低的CD4中枢记忆T细胞水平或CD4初始T细 胞与CD4中枢记忆T细胞亚群的高的或增加的比率表明治疗有效。
[0013] 一些实施方案提供在受试者中监测如糖尿病的自身免疫疾病的干预效果的方法， 所述方法包括：选择经历自身免疫疾病或病状治疗的受试者，从所述受试者提取样品，在所 述样品中测量⑶4中枢记忆（⑶45RO+⑶62L+) T细胞亚群以及任选地测量⑶4 T细胞初始 (CD45RO-CD62L+)亚群，以及评估所述疗法的有效性，其中在所述疗法期间低的或降低的 ⑶4中枢记忆T细胞水平或⑶4初始T细胞与⑶4中枢记忆T细胞亚群的高的或增加的比 率表明治疗有效。所述样品是例如在疗法开始之前（或在疗法开始之后但是在细胞群体中 的变化起始之前）以及在疗法进行大约三个月和/或六个月时从所述受试者提取。
[0014] 在其它实施方案中，提供一种在受试者中诊断自身免疫疾病、前自身免疫疾病、对 自身免疫疾病的易感性或疗法对一种或多种这些病状的有效性的方法，所述方法包括：选 择患有或疑似患有自身免疫疾病、前自身免疫疾病或具有对自身免疫疾病的易感性的受 试者，通过对从所述受试者提取的样品进行免疫荧光分析确定CD4初始（CD45R0-CD62L+) T细胞的水平；通过对从所述受试者提取的样品进行免疫荧光分析确定CD4中枢记忆 (⑶45R0+⑶62L+) T细胞的水平，以及定量地关联所述⑶4初始T细胞和⑶4中枢记忆T细 胞的水平，其中CD4初始T细胞与CD4中枢记忆T细胞的低的或降低的比率，或高的或增加 的CD4中枢记忆T细胞水平表明自身免疫疾病、前自身免疫疾病、对自身免疫的易感性或治 疗对一种或多种这些病状无效。
[0015] -些实施方案提供一种确定直到自身免疫疾病发病的时间的方法，所述方法包 括：获得具有对所述自身免疫病状为特异性的自身抗体的受试者；从所述受试者提取一个 或多个样品；在所述样品中测量中枢记忆（CD45RO+CD62L+)T细胞亚群水平以及任选地测 量CD4 T细胞初始（CD45RO-CD62L+)亚群水平，以及计算两个或更多个样品之间或在不同 时间点对一个样品进行的两个或更多个测量之间的所述CD4中枢记忆T细胞亚群水平的变 化和/或所述CD4初始T细胞与CD4中枢记忆T细胞亚群的比率的变化，其中所述比率的 降低和/或较高的CD4中枢记忆T细胞水平与自身免疫疾病发病的较短时间相关。举例来 说，Log中枢记忆从基线的每个单位的增加都与C肽浓度的大约-0. 178ng/mL的随后降低 相关。这种相关性可以用来测量和预测C肽水平下降的速度，因为这些T细胞群体中的数 量变化预示将要发生的C肽水平的数量变化。
[0016] -些实施方案提供一种确定不同干预模态（如用于糖尿病的不同临床试验）的 有效性水平的方法。这种方法包括在受试者中开始疗法，从所述受试者提取样品，在所述 样品中测量⑶4中枢记忆（⑶45R0+⑶62L+)T细胞亚群以及任选地测量⑶4 T细胞初始 (CD45R0-CD62L+)亚群，以及评估并且比较不同干预的有效性，其中所述比率的增加和/或 较低的CD4中枢记忆T细胞水平与较有效的干预相关。因此，提供了一种可靠地并且定量 地比较两种或更多种不同临床试验的活性臂（active arms)中所使用干预模态的有效性的 方式。
[0017] -些实施方案提供一种针对自身免疫的靶向药物开发方法，所述方法包括：从一 个或多个受试者提取样品，在所述样品中分离中枢记忆（CD45R0+CD62L+)T细胞亚群以及 任选地分离⑶4 T细胞初始（⑶45R0-⑶62L+)亚群，以及根据这些细胞的疾病特异性特征 开发特异性地靶向这些细胞或这些细胞的子集的药物。
[0018] 本文中阐述和描述将显而易见的实施方案的这些和其它特征。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 以下附图构成本说明书的一部分并且被包括来进一步说明本发明的某些方面。通 过参考这些附图中的一个或多个并结合本文中提出的特定实施方案的详细描述可以更好 地理解本发明。
[0020] 图1是展示与基线相比在先前随访时T细胞中每单位变化的C肽损失降低的图 表。展示了中枢记忆的降低和初始/中枢比率的增加。
[0021] 图2A至2D展示⑶4 T细胞子集从基线的变化百分比，其标识为（图2A)初始群 体和（图2B)中枢记忆群体以及（图2C)初始：中枢记忆的比率和（图2D) Treg群体，这 都是在治疗开始（"〇个月"）之后以指定的时间间隔来测量。最后的治疗是在第24个月。 实心圆圈是阿巴西普（abatac印t)治疗的，空心圆圈是安慰剂；符号表示平均值，误差线表 示95%置信区间。P值和虚线表明两个组在所指时间点显著不同。

【具体实施方式】
[0022] 1型糖尿病（TlDM)最常见的形式是免疫介导疾病，其中胰岛素分泌β细胞被自身 免疫应答破坏。T细胞在与TlDM相关的自身免疫中扮演核心角色。为了变得完全激活，据 信这些细胞需要至少两种关键信号。（Marelli-Berg FM, Okkenhaug Κ, Mirenda V. A Trends Immun〇12007 ;28:267-73)。第一信号是在抗原呈递细胞上的MHC分子的凹槽中的抗原与 T细胞受体之间的相互作用。第二信号是抗原递呈细胞上的CD80和CD86与T细胞上的 CD28之间的相互作用。这种共刺激第二信号是细胞完全激活需要的，并且没有它细胞就不 能起作用。因此，已经有人建议将共刺激阻断作为自身免疫和移植的治疗模态。（Bluestone JA, StClair Eff, Turka LA. Immunity 2006 ；24:233-38)〇
[0023] 初始T淋巴细胞移动到二级淋巴器官的T细胞区域寻找抗原递呈细胞（APC-s)所 呈递的抗原。一旦被激活，它们就迅速增殖，从而产生的效应细胞，所述效应细胞能够迀移 到发炎组织以对抗感染或在自身免疫的情况下破坏组织。在抗原清除时，一小部分的初始/ 激活T淋巴细胞继续作为循环记忆细胞，从而能够正常带来保护并且在二次激发时提供增 强的应答。两种主要类型的记忆T细胞保留：巡视淋巴器官的中枢记忆细胞，和充当如皮肤 和内脏的外周组织中的前哨细胞的效应记忆细胞。
[0024] 1型糖尿病（TlDM)自身免疫是受激活T淋巴细胞驱动。阿巴西普是一种共刺激 调节剂并且阻断完全的T淋巴细胞激活。已在新近确诊的患者的随机双盲试验中评估了 施用两年阿巴西普的效果。在两年中，阿巴西普显著地减缓β细胞功能的降低。这个试 验的初步结果已经在The Lancet上发表，文章标题为"Co-stimulation modulation with abatacept in patients with recent-onset Type ldiabetes: a randomized, double-bl ind, placebo-controlled trial"（2011年6月28日在线公布）。这篇论文作为附录A予 以包括并且是当前提交申请的一部分。
[0025] 已经分析了多种T细胞标记物与糖尿病病程的任何相关性（剩余胰岛素分泌β细 胞的破坏）。对于用减缓具有糖尿病体液生物标记物（GAA、ICA512AA、IAA)的患者中自身免 疫破坏的化合物所治疗的患者来说，已发现在治疗期间CD4 T细胞初始（CD45R0-CD62L+) 与中枢记忆（⑶45R0+⑶62L+)亚群比率从基线显著增加，并且随后在疗法结束之后回到基 线。还发现用阿巴西普的治疗通过降低⑶4 T中枢记忆（CD45R0+⑶62L+)细胞的水平显著 地减缓C肽的下降。
[0026] 对于未受治疗来减缓糖尿病病程（剩余胰岛素分泌β细胞的破坏）的患者来说， 发现较高的中枢记忆T细胞显著地与随后的C肽下降相关。因此，治疗组中的这些T细胞 的降低与C肽下降的较慢速率显著相关，并且这种T免疫细胞亚群（中枢记忆T细胞）可 被用作自身胰岛素产生下降的替代免疫标记物。
[0027] 因此，假设阿巴西普阻断初始细胞被激活，并且与⑶4记忆T细胞相比，更高浓度 的CD4初始T细胞的存在表明化合物对于延迟前糖尿病受试者的TlDM发病是有效的，并且 对于延迟TlDM患者的胰岛素产生的下降是有效的。阿巴西普通过降低⑶4中枢记忆T细胞 水平对自身免疫发挥其作用，因为它阻断CD4初始到CD4中枢记忆T细胞的激活过程。这 种生物标记物也可以在不存在如阿巴西普的化合物时，以用于诊断糖尿病或前糖尿病的进 行性（联用糖尿病抗体）以及确定对快速进展的糖尿病的易感性。这种标记物可以监测自 身免疫破坏的强度和侵害性、胰岛素分泌β细胞损失的速度。
[0028] 本文中描述的生物标记物分析可以联合已知的抗体测试来提供。这种组合提供对 糖尿病的易感性以及发病的时间框的测定。临床发病后，它可以预测达到全部丧失自身胰 岛素产生的时间-达到"完全糖尿病"的时间。
[0029] C肽是充当胰岛素原中的结构连接的31氨基酸肽。它在胰岛素原被酶催化裂解 时连同胰岛素一起释放进入循环中。因此，在TlDM患者中发现低水平到不可检测水平的C 肽，而T2DM患者在其疾病早期往往具有高于正常的胰岛素/C肽水平。然而，对于C肽水平 可以有几个参考范围，这取决于如所使用分析法的类型、患者年龄以及患者在试验之前是 否禁食等因素。任何已知的分析法都可以用来定量C肽，如放射免疫分析法（RIA)和免疫 化学发光分析法（ICMA)。在RIA方法中，可以使用山羊抗C肽测量C肽。所述抗体（也识 别胰岛素原）与胰岛素没有交叉反应性。所述试验的分析灵敏度一般是〇.125ng/ml并且 需要整夜禁食。RIA方法提供适于正常成年人的0. 5-2ng/mL的参考范围。在ICMA方法中， 使用两个孵育周期的竞争性免疫分析法来提供大约〇. 3ng/mL的分析灵敏度。ICM方法提 供适于正常成年人的0. 9-4ng/mL的参考范围并且患者必须禁食。对于小于12岁的儿童， 参考范围是0. 0至0. 3ng/mL。对于10-12岁的儿童，参考范围是0. 4至3. 3ng/mL，而对于 17岁及以上的个体。（LAB CORP)。为了评估胰岛素分泌β细胞产生胰岛素的能力，使用食 物激发试验，最常用的试验称为混合餐耐量试验（MMTT)，其中在2或4个小时的时间内采集 几个血液样品用于C肽测量。
[0030] 如本文中使用的术语"受试者"是患有或预期患有自身免疫性疾病的人或其它动 物。因此，在某些实施方案中，受试者需要本文中提供的治疗性治疗。优选的受试者是哺乳 动物。受试者的实例包括但不限于人、马、猴、犬、猫、小鼠、大鼠、奶牛、猪、山羊和绵羊。在 一些实施方案中，"受试者"一般是患有或预期患有糖尿病的人患者。在一些实施方案中， "受试者"是已经在过去的200、100或50天内确诊患有糖尿病的人患者。在一些实施方案 中，"受试者"是患有1型糖尿病的人患者。在一些实施方案中，"受试者"是前糖尿病的人 患者。在一些实施方案中，"受试者"是已经新近确诊患有糖尿病但是仍然具有残余的β细 胞功能的人患者。在一些实施方案中，"受试者"是除了 1型糖尿病患有自身免疫的人患者。 这种自身免疫包括但不限于类风湿性关节炎和多发性硬化。
[0031] 患有或预期患有自身免疫疾病或病状的受试者或患有或疑似患有自身免疫疾病、 前自身免疫疾病或对自身免疫疾病的易感性的人可以通过根据自身免疫疾病的诊断标准 进行评估来选择。替代地或另外，这种患者群体可以通过评估已知与自身免疫疾病、前自身 免疫疾病或对自身免疫疾病的易感性相关的任何遗传标记物或自身抗体或其它生物标记 物来选择。
[0032] 本文中使用的术语"治疗"或"治疗中"定义为对患者应用或施用治疗剂，或对来 自患者的分离组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述患者患有疾病、疾病的症状或有患病 倾向。希望治疗涵盖预防疾病发生、减缓疾病病程、使疾病逆转或缓解、改善或影响疾病、症 状或疾病症状或疾病倾向。例如，用本文中描述的组合物治疗受试者（例如，人受试者）可 以减缓、改善或终止1型糖尿病临床发病之前、期间或之后的受试者中的自身免疫的进行， 例如，针对胰腺β细胞的反应。
[0033] 如本文中使用的术语"糖尿病病状"意图涵盖糖尿病、前糖尿病或对糖尿病的易感 性。
[0034] 治疗可以是使用批准用于临床测试的药物成分的治疗，或可以是在临床试验或临 床前试验期间进行的治疗。
[0035] 如本文中使用的短语"延迟病程"在延迟糖尿病病程的情形中意指在1型糖尿病 的临床发病之前或之后功能性残余细胞群的损失被延迟。例如，所述延迟可以是延迟1、2、 3、4、5、6、9、12、15、18、21、24或更多个月，或可以延迟2、3、4或更多年。
[0036] 如本文中使用的术语"施用"意图涵盖直接和间接向其预期的作用位点递送药物 组合物的所有方式。
[0037] 术语"治疗有效量"是指在必要的剂量和时段下有效实现所需治疗结果的量。组 合物的治疗有效量可根据多种因素而不同，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及药 物组合物在个体中引出所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过药理学试 剂的任何毒性或有害效果的量。
[0038] 虽然以上描述提供各种实施方案的实例和具体细节，但是应理解，所描述实施方 案的一些特征和/或功能允许不脱离所描述实施方案的范围的修改。以上描述意图说明本 发明，其范围只受在随附权利要求书的语言限制。
[0039] 实施例
[0040] 根据下列实施例可以进一步理解 申请人:教义的方面，所述实施例不应当被解释为 以任何方式限制 申请人:教义的范围。
[0041] 实施例1-试验
[0042] 如以上参考Lancet论文（以全文引用方式并入本文）所述，使用阿巴西普对确 诊患有1型糖尿病的患者进行2期临床试验。适格患者已经在过去的100天内确诊患有1 型糖尿病并且具有至少一种糖尿病相关的自身抗体（微量分析的胰岛素抗体；谷氨酸脱羧 酶-65[GAD-65]抗体；胰岛-细胞抗原-512[ICA-512]抗体；或胰岛-细胞自身抗体）并且 具有0. 2nmol/L或更高的受激C肽浓度。
[0043] 通过在参与现场划分将患者以2:1的比率随机分配，使用双盲方案得到用阿巴 西普或安慰剂的实验治疗。在第1、14和28天给予阿巴西普（Orencia, Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA)，并且随后每28天以在IOOmL 0· 9 %氯化钠输注液中IOmg/ kg(每个剂量最大IOOOmg)的剂量，以30-min静脉内输注方式来给药，其中在第700天给予 最一剂（总共27个剂量）。使用生理盐水输液作为安慰剂。患者不接受任何术前用药。
[0044] 集中分析血液样品。用双位点免疫酶分析法（Tosoh Bioscience, South San Francisco, CA, USA)从冷冻血浆测量C肽浓度。在给药结束六个月之后，在3、6、12、18和 24个月以及在30个月获得血液样品。
[0045] 在参加研宄的112位患者中，随机分配77位接受用阿巴西普的实验治疗，并且分 配35位接受安慰剂。结果显示：用阿巴西普进行2年以上的共刺激调节使最新发病的1型 糖尿病中的β细胞功能降低减缓9.6个月。在两年时，阿巴西普治疗组的自身胰岛素产生 比安慰剂组高59%。整个试验（用相同的胰岛素用量）中，阿巴西普治疗组也具有显著更 好的HbAlc (血糖控制水平的测量）。即使所述疾病过程可能已经发展若干年，早期干预的 有益效果暗示出T细胞激活仍然在1型糖尿病临床诊断的时间前后发生。
[0046] 实施例2-流式细胞术
[0047] 对于阿巴西普和安慰剂臂两者来说，在0、3、6、12和24个月时，对来自实施例1中 的临床试验的受试者的血液样品执行流式细胞术分析，在试验结束之后六个月（30个月） 进行另外的分析。流式细胞术是用于计数和检验微观颗粒（如细胞）的常规技术，它是通过 将微观颗粒悬浮在流体流中并且使它们一次一个细胞通过激光和电子检测设备来进行。现 代仪器通常具有多个激光和荧光检测器。增加激光和检测器的数目允许进行多抗体标记， 并且可以通过其表型标记物更精确地识别目标群体。
[0048] 在所述分析中使用荧光激活细胞分选（FACS)，它是流式细胞术的一种特殊化类 型。FACS提供一种将生物细胞的异质混合物每次一个细胞分选到两个或更多个容器中的方 法，所述方法是基于每个细胞的特定光散射和荧光特征以及对它们的表征。它是一种有用 的科学仪器，因为它提供对来自单个细胞的荧光信号的快速、客观和定量的记录以及对特 别感兴趣的细胞的物理分离。荧光信号来自FACS之前已经与细胞一起孵育的荧光标记的 抗体。对于多标记来说，每个抗体与不同荧光团偶联。使用的抗体对于感兴趣的细胞标记 物是特异性的。为了检测⑶4+细胞，用荧光团标记抗⑶4抗体。对于⑶45RO的同时检测 来说，还使用带有另一个荧光团的特异性抗CD45RO抗体。（荧光标记的抗CD4和抗CD45RO 抗体可商购自各种来源，如BD Biosciences, San Jose, CA.)每个焚光团都有特征峰激发和 发射波长，因此使在它们之间加以区分成为可能，例如，通过使用荧光激活细胞分选仪器， 如 Becton-Dickinson FACSCalibur 或 FACSAria 系统来进行区分。
[0049] 在三个5色分析法中研宄七个T细胞标记物。对于任何这些标记物来说，在安慰 剂组中没有发现从基线的变化。在治疗组中，我们观察到CD4和CD8T细胞中或CD8T细胞 的初始子集和记忆子集中没有变化。
[0050] 然而，在治疗期间的阿巴西普组中⑶4 T细胞初始（⑶45R0-⑶62L+)与中枢记忆 (⑶45R0+⑶62L+)亚群的比率从基线显著地增加并且中止疗法后又回到基线。在安慰剂组 的试验期间，更高的⑶4中枢记忆T细胞显著地与随后的C肽下降相关。在阿巴西普组中 这些T细胞的降低显著地与C肽下降速率减慢相关。
[0051] 研宄还发现在阿巴西普组中，调节性T细胞群体（⑶4+⑶25高）从基线降低，随后 在中止疗法后回到基线。然而，这些调节性T细胞的降低显示与初始/记忆群体的变化或 与C肽水平的变化不相关。
[0052] 表1提供⑶4初始T细胞与⑶4中枢记忆T细胞的比率从基线的最小二乘方平均 变化（作为log给出）和从基线起3、6、12和24个月的标准偏差和p值。从基线起30个 月以第30个月的数据给出，其中所述受试者在第30个月中止疗法。药物与安慰剂组之间 的P值是在同一次随访时各组之间的P值。
[0053] 表 1
[0054] LOG (初始T细胞/中枢记忆T细胞）
[0055]

【权利要求】
1. 一种在受试者中确定疗法对自身免疫疾病或病状的有效性的方法，所述方法包括： 选择经历自身免疫疾病或病状的疗法的受试者， 从所述受试者提取样品， 在所述样品中测量⑶4中枢记忆（⑶45R0+⑶62L+) T细胞亚群并且任选地测量⑶4T细 胞初始（CD45R0-CD62L+)亚群，以及 评估所述疗法的所述有效性，其特征在于：在所述疗法期间 低的或降低的CD4中枢记忆T细胞水平，或 所述CD4T细胞初始亚群与所述CD4中枢记忆T细胞亚群的高的或增加的比率表明有 效的疗法。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述测量步骤之前，用标记的抗CD45R0 抗体和标记的抗CD62L抗体孵育所述样品。
3. 如权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于：测量包括使所述样品经受流 式细胞术。
4. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：所述样品是血液样品。
5. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：所述降低的CD4中枢记忆T细 胞水平或所述增加的比率是相对于在不同时间点所述提取的样品的所述水平或比率而言。
6. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于：所述降低的CD4中枢记忆T细 胞水平或所述增加的比率是相对于标准化的水平或比率而言，或相对于从疗法开始之前提 取的样品获得的水平或比率而言。
7. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：在所述疗法期间低的或降低的 所述CD4中枢记忆T细胞水平表明有效的疗法。
8. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：测量包括测量所述CD4中枢记 忆T细胞亚群和所述CD4T细胞初始亚群两者，并且其中在所述疗法期间所述CD4T细胞初 始与所述CD4中枢记忆T细胞亚群的高的或增加的比率表明有效的疗法。
9. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：所述疗法是针对糖尿病病状。
10. 如权利要求9所述的方法，所述方法还包括： 确定糖尿病相关自身抗体的存在。
11. 如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述糖尿病病状是1型糖尿病。
12. -种在受试者中诊断自身免疫疾病、前自身免疫疾病、对自身免疫疾病的易感性或 疗法对一种或多种这些病状的有效性的方法，所述方法包括： 选择患有或疑似患有自身免疫疾病、前自身免疫疾病或具有对自身免疫疾病的易感性 的受试者， 通过对从所述受试者提取的样品进行免疫荧光分析确定CD4初始（CD45R0-CD62L+)T 细胞的水平； 通过对从所述受试者提取的样品进行免疫荧光分析确定CD4中枢记忆 (CD45RO+CD62L+)T细胞的水平，以及 定量地关联所述CD4初始T细胞和所述CD4中枢记忆T细胞的所述水平，其特征在于： 所述CD4初始T细胞与所述CD4中枢记忆T细胞的低的或降低的比率，或高的或增加的所 述CD4中枢记忆T细胞水平表明自身免疫疾病、前自身免疫疾病、对自身免疫的易感性或治 疗对一种或多种这些病状的无效性。
13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述自身免疫疾病是糖尿病或前糖尿病， 其中所述CD4初始T细胞与所述CD4中枢记忆T细胞的低的或降低的比率，或高的或增加 的所述CD4中枢记忆T细胞水平表明糖尿病、前糖尿病或对糖尿病的易感性。
14. 如权利要求13所述的方法，所述方法还包括：确定糖尿病相关的抗体的存在，所述 糖尿病相关的抗体选自谷氨酸脱羧酶-65抗体、胰岛-细胞抗原-512抗体、胰岛素抗体或 其它胰岛-细胞自身抗体。
15. 如权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于：所述糖尿病病状是1型糖 尿病。
16. 如权利要求12至15中任一项所述的方法，其特征在于：在分析之前用标记的抗 ⑶45R0抗体孵育所述样品。
17. 如权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于：测量包括使所述样品经受 流式细胞术。
18. 如权利要求12至17中任一项所述的方法，其特征在于：所述样品是血液样品。
19. 如权利要求12至18中任一项所述的方法，其特征在于：所述降低和/或增加的水 平或比率是相对于在不同时间点来自所述提取的样品的所述水平或比率而言，或相对于标 准化的水平或比率而言。
20. -种确定直到自身免疫疾病发病的时间或不同干预模态的有效性水平的方法，所 述方法包括： 获得受试者； 从所述受试者提取一个或多个样品； 在所述样品中测量中枢记忆（⑶45RO+⑶62L+) T细胞亚群水平以及任选地测量⑶4T细 胞初始（⑶45RO-⑶62L+)亚群水平，以及 计算两个或更多个样品之间或在不同时间点对一个样品进行的两个或更多个测量之 间的所述CD4中枢记忆T细胞亚群水平的变化，和/或所述CD4T细胞初始与所述CD4中枢 记忆T细胞亚群的比率的变化， 其特征在于：所述比率的降低和/或较高的CD4中枢记忆T细胞水平与自身免疫疾病 发病的较短时间或有效性较低的干预相关。
21. 如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述受试者具有对所述自身免疫病状为 特异性的自身抗体或其它生物标记物。
22. 如权利要求20或权利要求21所述的方法，其特征在于：所述受试者具有至少一 种糖尿病相关的抗体，所述糖尿病相关的抗体选自谷氨酸脱羧酶-65抗体、胰岛-细胞抗 原-512抗体、胰岛素抗体或其它胰岛-细胞自身抗体，并且其中所述比率的降低和/或较 高的所述CD4中枢记忆T细胞水平与糖尿病发病的较短时间相关。
23. 如权利要求20至22中任一项所述的方法，其特征在于：Log中枢记忆T细胞从基 线的每个单位的增加都与C肽浓度降低大约-0. 178ng/mL相关。
24. 如权利要求20至23中任一项所述的方法，其特征在于：以介于2个月与12个月 之间的间隔从所述受试者提取至少两个样品。
25. 如权利要求24所述的方法，其特征在于：以介于3个月与6个月之间的间隔从所 述受试者提取至少两个样品。
26. 如权利要求20至23中任一项所述的方法，其特征在于：在间隔介于1个月与6个 月之间的至少两个不同时间点测量从所述受试者提取的所述样品。
27. 如权利要求20至26中任一项所述的方法，其特征在于：在所述测量步骤之前用标 记的抗⑶45RO抗体孵育所述样品。
28. 如权利要求20至27中任一项所述的方法，其特征在于：测量包括使所述样品经受 流式细胞术。
29. 如权利要求20至28中任一项所述的方法，其特征在于：所述样品是血液样品。
30. 如权利要求20至29中任一项所述的方法，其特征在于：所述水平的增加和/或所 述比率的降低是相对于开始疗法之前的所述水平或比率而言，或相对于标准化的水平或比 率而言。
31. 如权利要求20至29中任一项所述的方法，其特征在于：所述水平的增加和/或所 述比率的降低是相对于来自同一样品的在较早时间点的所述水平或比率。
32. -种针对自身免疫的靶向药物开发方法，所述方法包括： 从一个或多个受试者提取样品， 在所述样品中分离中枢记忆（⑶45RO+⑶62L+) T细胞亚群以及任选地分离⑶4T细胞初 始（CD45RO-CD62L+)亚群，以及 根据这些细胞的疾病特异性特征开发特异性地祀向这些细胞或这些细胞的子集的药 物。
33. 如权利要求32所述的方法，其特征在于：所述方法是针对糖尿病的靶向药物开发 方法。
【文档编号】A61P37/00GK104520707SQ201380027247
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2012年5月24日
【发明者】泰汉摩·欧尔本 申请人:欧尔本生物科技有限责任公司