专利名称：与糖尿病中的mirna相关的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病中的微小RNA分子和微小RNA表达谱，包括糖尿病慢性病。
背景技术：
在本发明全文中，在方括号内引用了多篇参考文献以便更加完整的描述与本发明相关的背景技术。糖尿病视网膜病变几乎所有的I型糖尿病患者和60%的II型糖尿病患者都会发展成视网膜病变。到2030年，预计全球糖尿病患者将会达到3. 66亿。在加拿大，糖尿病患者数超过200万人，其中，约10%为I型糖尿病，约90%为II型糖尿病。在北美洲，糖尿病视网膜病变(DR)是导致失明的最重要的系统性原因。已有研究证实糖尿病视网膜病变中有几种蛋白质分子发生改变。针对治疗糖尿病视网膜病变的个别蛋白质的实验研究已开展了很长时间，但迄今为止所有的努力都没有在临床上取得成功。在所有的糖尿病慢性并发症中，包括糖尿病视网膜病变，血管内皮损伤是一个重要特征。内皮细胞排列在血管壁上，它对葡萄糖的摄取不依赖于胰岛素。当糖尿病患者体内血糖水平升高时,葡萄糖流入到内皮细胞中，导致内皮细胞损伤。视网膜病变分为两种类型，或者说两个阶段非增生性视网膜病变和增生性视网膜病变。在非增生性糖尿病视网膜病变阶段，眼睛中有些地方(微血管瘤)血管扩张。也可能出现血管堵塞。可能有少量出血(视网膜出血)，和液体渗漏到视网膜内。增生性视网膜病变阶段是更晚期和更严重的疾病状态。眼睛内开始生长出新的血管(血管生成)。这些新的血管非常脆弱并可能流血(出血)。随后视网膜和眼睛的其他部分(玻璃体)出现小块疤痕。最终的结果是视力丧失，以及其他问题。微小RNA微小RNA( “miRNA”)是近年来发现的自然界中存在的分子。miRNA是小的RNA分 子(约由20-25个核苷酸组成)，其在调节基因表达中起到重要作用I。miRNA通过RNA聚合酶II转录，形成带有5’帽子结构和多聚腺苷酸尾巴结构的初级miRNA。初级miRNA在细胞核中加工成前体miRNA(由70-100个核苷酸组成的发夹结构)，是通过三种酶RNA酶II，Drosha和DGCR8调节的。前体miRNA形成后就通过核输出蛋白-5输出到细胞质中。在细胞质中，RNA酶III核糖核酸酶家族成员Dicer将前体miRNA进一步加工成成熟miRNA，即功能活性形式1，2。成熟的miRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC) —起结合到特定的mRNA靶上，引起特定的mRNA降解或者转录遏制1，2。一些研究者采用超表达实验证明了miRNA在多种细胞过程中的重要性。也有研究认为miRNAs在控制组蛋白修饰方面也起到重要作用3。大量的miRNA编码区位于蛋白编码基因的内含子区，并被认为与它们的宿主基因被共同调控。不过，它们也有可能是被自己的启动子调控的。已从恶性肿瘤中识别出几种miRNAs。研究表明它们可以调控多种因子，包括致癌基因(c-MYC)，转录因子(NFkB)和甲基化因子1，2。有关miRNA在多种疾病中的潜在治疗应用在科学界引起了相当大的兴趣。从机理的角度看，一种miRNA可以调控多种基因，因此，靶向于一种或少数几种miRNAs提供了阻止多种基因表达的潜在的独特机会。由于靶miRNAs作用的特异性，这种以RNA为基础的疗法是非常有吸引力的。miRNA表达的脱调节可能引起疾病，因此，检查miRNA的表达可能成为一种有用的诊断手段。糖尿病中的miRNA
没有研究文献表明糖尿病个体视网膜中的特定miRNAs发生了显著改变。然而，对其他糖尿病并发症的研究表明miRNA已发生改变。比如，已有研究发现，在糖尿病中miR375的改变参与葡萄糖诱导的胰岛素基因表达过程4。研究发现，在2型糖尿病大鼠心脏微血管内皮细胞内miR320表达上调5。研究表明，MiR377通过调节P21-活化激酶和超氧化物歧化酶使得糖尿病肾病中纤维连接蛋白生成增加6。研究已发现，在糖尿病肾病中mil92通过影响TGFii诱导的胶原蛋白表达而发生改变7。在糖尿病兔子心脏中发现miR133减少，从而调节HERG钾离子通道引起QT波延长8。此外，miRl参与葡萄糖诱导的心肌细胞凋亡过程。申请人最近的研究发现，在糖尿病大鼠的心脏和暴露于葡萄糖的心肌细胞中都出现了 miR133a的下调，这直接关系到心肌细胞肥大9。在非糖尿病性心肌肥厚的其他研究中，也发现了 miRl和miR133的下调10，11。国际申请WO 2009/045356 (W0 ‘356)中公开了通过施用miRNAs来改变血管内皮生长因子(VEGF)诱导细胞和组织响应或改变的能力来治疗疾病的方法。W0‘356还公开了治疗伤口痊愈和癌症、炎症和黄斑变性等疾病的方法。但是，WO ‘356中并没有公开暴露于葡萄糖的细胞中或者糖尿病受试者视网膜中哪些miRNAs发生了改变。本领域需要一种有效的治疗方法来治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关的疾病，包括糖尿病慢性并发症，比如糖尿病视网膜病变。本领域也需要一种健全的早期检测糖尿病的方法。发明概述在一方面，本发明提供一种治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给受试者施用一种能够调节所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。在另一方面，本发明提供一种治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的组合物，包括一种能够调节所需一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物，和药学上可接受的载体。在本发明中，所述成分或成分的混合物能够上调所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。在一方面,所述一种或多种miRNAs中的至少一种 miRNA 选自 miR-1，miR-146a, miR200b 或者 miR-320。在本发明中，所述成分或成分的混合物包括一种寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。在本发明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或类似物、miRNA前体、成熟miRNA或者编码所述至少一种miRNA的DNA分子的形式提供。在本发明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以一种包括药学上可接受的载体的组合物的形式提供。在本发明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物选自SEQ ID NOs. 1_4。在本发明中，所述成分或成分的混合物以不超过一种给药载体的方式提供。在本发明中，所述给药载体选自病毒载体，微球，脂质体，胶体金颗粒，脂多糖，多肽，多糖，或聚乙二醇化病毒载体。在本发明中，所述成分或成分的混合物能够下调所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。在一方面,所述一种或多种miRNAs中的至少一种 miRNA 选自 miR-144 或者 miR-450。 在本发明中，所述成分或成分的混合物包括所述的至少一种miRNA的抑制剂或抑制剂的混合物。在本发明中,所述抑制剂或抑制剂的混合物选自antagomir、反义RNA或者短干扰RNA。在本发明中，所述抑制剂或抑制剂的混合物以一种包括药学上可接受的载体的组合物的形式提供。在本发明中，所述疾病是糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病大血管病变。在本发明中，所述成分或成分的混合物通过胃肠外给药途径或者局部给药途径施用。在本发明中，所述疾病是糖尿病视网膜病变，所述成分或成分的混合物通过眼内给药或者局部滴注到眼内的方式施用。在本发明中，所述疾病是糖尿病视网膜病变，所述成分或成分的混合物通过眼部植入的方式施用。在另一方面，本发明提供一种治疗受试者的糖尿病视网膜病变的方法，其特征在于，所述方法包括给受试者施用一种组合物，包括至少一种(a)祀向于miR-1, miR-146a,miR-200b或者miR-320的寡核苷酸，和(b)miR_144或者miR-450的抑制剂。在另一方面，本发明提供一种诊断受试者所患疾病的方法，所述疾病与葡萄糖介导的细胞损伤相关，其特征在于，所述方法包括检测受试者样本中的一种或多种miRNAs的表达谱，其中受试者样本的miRNA表达谱与正常样本或参考样本的miRNA表达谱的差异就是葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的指征。在本发明的诊断疾病的方法的一方面，所述疾病是糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病大血管病变。在本发明的诊断疾病的方法的一方面，所述方法是诊断受试者糖尿病视网膜病变的方法。在本发明的诊断疾病的方法的一方面，所述一种或多种miRNAs选自miRl，miR146a, miR200b, miR320, miR144 或者 miR450。在本发明的诊断疾病的方法的一方面，与正常样本或者参考样本相比miRl，miR146a, miR200b和miR320的下调和miR144或者miR450的上调就是该疾病的指征。本发明具有如下优势(a)miRNAs是天然成分，当作为药物使用时是非常特异性的，
(b) miRNAs的合成非常容易，(C)HiiRNAs可以通过眼内注射到玻璃体内。玻璃体内给药是公认的治疗视网膜疾病的方法，和(d) miRNAs可用于诊断糖尿病和糖尿病并发症，包括糖尿病视网膜病变。提供了一种早期诊断这类疾病的新方法。附图简述参考下列的详细描述本发明将会被更好的理解，发明目的将变得清晰。描述参考附图，其中图I是miRNA阵列-散点图，显示出对照组与链脲佐菌素(STZ)诱导的(一种I型糖尿病模型)糖尿病组(处理组)大鼠视网膜中miRNA的改变情况。
·
图2a)是暴露于低浓度葡萄糖(LG)和高浓度葡萄糖(HG)的内皮细胞中的miR320表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。图b)_d)显示内皮细胞中的下列因子表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图(b)纤维连接蛋白(FN)mRNA, (c)内皮素-l(ET-l)mRNA和(d)血管内皮生长因子(VEGF)mRNA，所述内皮细胞分别暴露于高浓度葡萄糖(HG)，低浓度葡萄糖(LG)，暴露于高浓度葡萄糖并经阴性mRNA转染(HG+neg)，暴露于高浓度葡萄糖并经miR320模拟物转染(HG+miR320)。图e)显示了内皮细胞中的有丝分裂原激活的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MAPK(ERKl/2))的激活作用，所述内皮细胞分别暴露于低浓度葡萄糖(LG)，高浓度葡萄糖(HG)，经阴性转染并暴露于低浓度葡萄糖或高浓度葡萄糖(LG+Neg，HG+Neg)，经miR320模拟物转染并暴露于低浓度葡萄糖或高浓度葡萄糖(LG+miR320，HG+miR320)。*代表与低浓度葡萄糖组(LG)相比具有统计学意义上的显著差异。图3a)是分别暴露于25mmol/L葡萄糖和5mmol/L葡萄糖的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中，和暴露于25mmol/L葡萄糖并经阴性miRNA转染(25mM+Scram)或者经miR146a模拟物转染(25mM+miR146a)的内皮细胞中的miRNA 146a表达水平的实时定量聚合酶链式反(qRT-PCR)应分析图。图b)_c)是人脐静脉血管内皮细胞中的下列因子表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)分析图，
b)纤维连接蛋白(FN)mRNA和c)纤维连接蛋白水平，所述人脐静脉血管内皮细胞分别暴露于5mmol/L葡萄糖和25mmol/L葡萄糖，以及暴露于25mmol/L葡萄糖并经阴性(序列打乱的)miRNA 转染(25mM+Scram)或者经 miR146a 模拟物转染(25mM+miR146a)。Scram 表不序列打乱的，*表示与5mM组或者5mM scram组相比具有统计学意义上的显著差异；**表示与25mM组或25mM scram组相比具有显著差异；miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表达，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG组)的水平；mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并归一化到LG组的水平。图4a)显示了链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠(D)视网膜组织中miR146a的水平与年龄和性别匹配的对照组(C)中miR146a的水平对比情况。图b)显示了玻璃体内给药的效率，其中，向玻璃体内注射miR146a模拟物(D+146a)导致视网膜内miR146a水平升高，而注射序列打乱的模拟物(D+SC)组并没有出现miR146a水平升高的现象。图c)_d)显示链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜组织中的纤维连接蛋白(FN) (c)mRNA水平和(d)蛋白质水平。该图显示向玻璃体内注射miR146a模拟物(D+miR146a)可以阻止糖尿病诱导的纤维连接蛋白(FN)mRNA水平和蛋白质水平的上调，而注射序列打乱的模拟物的对照组(D+Sc)并没有发现这一现象。数据以I，c) RNU6 (U6), d) 18S的比值的形式表示，*表示与对相应的C组相比具有统计学意义上的显著差异，η为5例/每组。图5a)是基于生物信息学预测的(www. TargetScan. org, www. microrna. org, www.ebi.ac.ukl)纤维连接蛋白(FNl) 3’UTR序列与成熟miR146a序列的对比图。图b)_c)显不miR146a与(b)人和(c)大鼠FNl启动子结合的突光素酶报告分析图。**表不与单独的载体组或者载体+序列打乱物组相比具有统计学意义上的显著差异。图6a)是对照大鼠视网膜组织的LNAtm-ISH研究的显微照片，显示了 miR146a的定位。图(b)是(a)组的高倍显微镜照片，显示了视网膜毛细血管的阳性染色(箭头)。图c)是链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜组织的LNAtm-ISH研究的显微照片，显示了miR146a在毛细血管内(箭头)的最小表达量(如果有的话)。用碱性磷酸酶(ALK Pho)作为色原体，不加复染剂。
图7显示了人脐静脉内皮细胞中的核因子-KB(NF-KB)的活力。X轴显示了下列条件人脐静脉内皮细胞暴露于5mmol/L葡萄糖,25mmol/L葡萄糖,和暴露于25mmol/L葡萄糖并经阴性miRNA转染(25mM+Scram)或者经miR146a模拟物转染(25mM+miR146a)。*表示与其他组相比具有统计学意义上的显著差异。数据归一化到5mM葡萄糖组的水平。图8显示了 db/db糖尿病小鼠(db/db)( 一种2型糖尿病的模型)视网膜组织中的miR146a水平与年龄和性别匹配的对照组(C)的miR146a水平的对比图。数据以RNU6(U6)比值的形式表达，*表示与其他组相比具有统计学意义上的显著差异。图9显示了糖尿病大鼠视网膜内的微小RNA和血管内皮生长因子的变化情况。非糖尿病对照组和糖尿病组(链脲佐菌素诱导，患病I个月后)大鼠视网膜组织样本的图a)实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图和图b)酶联免疫法分析图都显示糖尿病大鼠视网膜中血管内皮生长因子mRNA和蛋白质水平都升高。图c)是糖尿病大鼠与非糖尿病对照组大鼠视网膜中miR200b水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。miRNA的数据以RNU6B(U6)的比值的形式表示，并归一化到对照组的水平；(mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并归一化到对照组的水平。*表示与其他组相比具有统计学意义上的显著差异。)
图10显示了葡萄糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞中miR200b水平下调的影响。图a)显分别暴露于25mmol/L葡萄糖(HG), 5mmol/L葡萄糖(LG),和25mM L-葡萄糖(渗透对照，0SM)的人脐静脉血管内皮细胞中的miR200b的表达水平。图b)显示了人脐静脉血管内皮细胞中血管内皮生长因子mRNA的表达水平，所述的人脐静脉血管内皮细胞分别暴露于低浓度葡萄糖(LG)、高浓度葡萄糖(HG)、25mM L-葡萄糖(OSM)、经序列打乱的(scr)模拟物或者miR200b转染并暴露于低浓度葡萄糖(LG+Scr ；LG+200b)或高浓度葡萄糖(HG+Scr ;HG+200b),和经 antagomirs 转染[200b (A)]以及经 antagomirs 转染并暴露于低浓度葡萄糖[LG+200b (A)]。图c)中与经序列打乱的(scr)模拟物组相比，经miR200b模拟物转染后暴露于高浓度葡萄糖的人脐静脉血管内皮细胞中miR200b表达水平的增加显示了 miR200b模拟物转染的效率。图d)显示与人脐静脉血管内皮细胞类似，牛视网膜血管内皮细胞(BREC)中也显示出葡萄糖诱导的miR200b水平下调。图e)显示，用miR200b模拟物(采用在PcDNA3. I载体中克隆的miR200b(V200b)，而不是通过空白载体(V))转染牛视网膜血管内皮细胞能够使得高浓度葡萄糖诱导的VEGF mRNA表达的上调恢复正常。图f)中与载体对照组相比，经miR-200b模拟物转染的牛视网膜血管内皮细胞中miR-200b表达水平的提高程度显示了 miR-200b模拟物在牛视网膜血管内皮细胞中的转染效率。(低浓度葡萄糖(LG) = 5mM葡萄糖,Scr =序列打乱的miRNA, 200b = miR200b模拟物,200b (A)=200b antagomir, OSM = 25mML葡萄糖[渗透对照]。*表示与LG组或LG scram组相比具有显著差异，+表示与HG组或者HG scram组相比有显著差异。miRNA的水平以RNU6B (U6)的比值的形式表达，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG)的水平。mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG)的水平。图11显示由高浓度葡萄糖(HG)诱导的和血管内皮生长因子(VEGF)介导的跨内皮通透性增加可以通过miR200b模拟物转染(200b)而被阻止，但不能通过序列打乱的(scr)模拟物转染而被阻止，图a)为时间依赖性数据，图b)为终点数据。图c)显示，类似地，葡萄糖诱导的内皮细胞(EC)管腔形成可以通过miR200b模拟物转染而被阻止，但不能通过序列打乱的(scr)模拟物转染而被阻止。图d)显示了管形成实验的量化分析。 (低浓度葡萄糖(LG)= 5mM葡萄糖,Scr =序列打乱的miRNA, 200b = miR200b模拟物，200b (A) = 200b antagomir, OSM = 25mM L葡萄糖(渗透对照).*表示与LG组或者LGscram组相比具有显著差异，+表示与HG组或者HG scram组相比具有显著差异。miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表达，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG)的水平；mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表达，并归一化到低浓度葡萄糖组(LG)的水平)。图12a)显不基于生物信息学预测的(www.TargetScan.org, www.microma.org，www.ebi.ac.ukl)血管内皮生长因子3’ UTR序列(和突变的[mut]血管内皮生长因子3，-_与成熟miR200b序列的对比图。图b)(人)和图c)(大鼠)是miR200b与血管内皮生长因子启动子结合的荧光素酶报告分析图，显示了 miR200b与血管内皮生长因子3’ UTR的剂量依赖性的结合。相关启动子的活性以发光单位归一化为β_半乳糖苷酶表达水平的方式表达，*表示与单独载体组或者载体+序列打乱物组相比具有统计学意义上的显著差
巳图13显示了 miR200b调节的视网膜血管内皮生长因子的改变及其被miR200b阻止。图a)和图b)分别是经过或者未经过玻璃体内注射miR200b模拟物(200b)和序列打乱的模拟物(Scr)的对照组(Cont)和糖尿病组(Diab)大鼠(链脲佐菌素诱导)视网膜中的a)血管内皮生长因子mRNA和b)蛋白水平的情况。图c)中与注射序列打乱的模拟物组相比，玻璃体内注射miR200b模拟物后视网膜中miR200b表达量的增加显示了玻璃体内给药的效率。*表示与对照组或者Diabetic+scr组(右图)相比具有统计学意义上的显著差异，+表示与糖尿病组(diabetic)比较有显著差异。图14的显微照片显示了 miR200b介导的糖尿病视网膜血管内皮生长因子改变的功能性结果。a)是对照大鼠视网膜组织的LNAtm-ISH研究的显微照片，显示了 miR200b在视网膜毛细管内皮(箭头)，神经节细胞(楔形箭头)，内核层细胞(双楔形箭头，在神经胶质和神经元内)中的定位；插图为带有细胞质和细胞核miR200b定位的毛细管放大图(箭头)。图b)是链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜内的视网膜组织(与(a)组中的定位相似)的LNAtm-ISH研究的显微照片，显示了 miR200b的最小表达量(如果有的话)。图c)是用抗白蛋白抗体对对照组大鼠视网膜进行免疫细胞化学染色的显微照片，显示有血管内白蛋白出现(箭头)。图d)是对糖尿病大鼠(链脲佐菌素诱导)的视网膜进行与(C)组类似的免疫细胞化学染色的显微照片，显示出现血管内反应(箭头)和视网膜的弥漫着色，说明血管通透性增加。图e)的显微照片显示链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠视网膜经玻璃体内注射miR200b之后，白蛋白染色仅出现在血管内的间隔中(箭头)。在LNAtm-ISH实验中，用碱性磷酸酶(ALK Pho)作为色原体，不加复染剂。在白蛋白染色中使用DAB色原体和苏木精复染剂。图15显示mir200b调节糖尿病诱导的p300的变化。图a)显示在以下情况下人脐静脉内皮细胞中的p300mRNA水平上调人脐静脉内皮细胞分别暴露于5mmol/L葡萄糖(LG), 25mmol/L葡萄糖(HG),暴露于25mmol/L葡萄糖并经阴性miRNA转染(HG+Scram)或者经miR200b模拟物转染(HG+200b)。图b)显示了 miR200b在人脐静脉内皮细胞内的表达情况。未观察到p300siRNA转染对miR200b表达量的影响。图c)显示糖尿病大鼠视网膜中P300mRNA的表达情况(与对照组比较)。*表示与对照组或者低浓度葡萄糖组(LG)相比具有统计学意义上的显著差异。+表示与糖尿病组(diabetic)或高浓度葡萄糖组(HG)相比具有显著差异，scram =序列打乱的对照组。·图16a)是来自非糖尿病的人视网膜的视网膜组织的LNAtm-ISH研究的显微照片，显示了 miR200b在视网膜毛细管(箭头)和内核层细胞(双楔形箭头)中的定位。插图是带有内皮染色的毛细管(箭头)的高清图片。图b)是糖尿病人视网膜(与(a)组中的定位相似)的显微照片，显示了 miR200b的最小表达量(如果有的话)。图c)是用抗白蛋白抗体对非糖尿病人的视网膜进行免疫细胞化学染色的显微照片，显示有血管内白蛋白出现(箭头)。图d)是糖尿病人视网膜的显微照片，显示血管内白蛋白染色(箭头)和视网膜的弥漫着色，说明血管通透性增加。在LNAtm-ISH实验中，用碱性磷酸酶(ALK Pho)作为色原体，不加复染剂。在白蛋白染色中使用DAB色原体和苏木精复染剂。图17是对照组和糖尿病组(一种2型糖尿病的模型)(db/db)小鼠的视网膜中的miR200b表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。*表示与对照组相比具有统计学意义上的显著差异。图18是对照组和糖尿病动物组大鼠视网膜中的miRl表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。与正常(对照)组大鼠视网膜相比较，糖尿病大鼠视网膜中的miRl表达水平具有统计学意义上的显著减少。*表示与对照组相比较P < O. 05。图19a)是对照组和糖尿病组大鼠(链脲佐菌素诱导，I型糖尿病模型)视网膜组织样本中miR144表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。图b)是对照组和糖尿病组大鼠视网膜组织样本中miR450表达水平的实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析图。*表示与对照组相比较P < O. 05。图20是来自两名患有增生性糖尿病视网膜病变患者的玻璃纤维组织的扩增曲线(实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析)，显示了 miR146a和miR320的存在。在附图中，本发明的实施方案是通过举例的方式说明的。应当明确理解的是，说明书和附图只用于说明和帮助理解的目的，并不意味着对本发明的范围进行限制。发明的详细描述除非另有规定，本发明中使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常已知的含义。此外，除非另有说明，除了在权利要求书中，使用“或”时也包括“和”的意思，反之亦然。除非有明确规定或者在上下文清楚的另外指明，开放式的术语不应解释成限制性的术语(例如“包括”，“含有”和“包含”通常表明“包括但不限于”)。除非另有明确规定，包括在权利要求书中使用的单数形式如“一”和该”也包括多个指代物。本发明将通过引用附图对发明内容进行详细的解释。本发明涉及发现暴露于相对高浓度葡萄糖的细胞中和糖尿病受试者的视网膜中的微小RNA(miRNA)表达水平的改变。申请人:发现暴露于相对高浓度葡萄糖的细胞中和糖尿病受试者的细胞中，包括糖尿病受试者视网膜中的某些miRNAs的表达谱发生改变。申请人进一步发现，miRNAs表达的改变可能与一些已知的在糖尿病中起到重要作用的蛋白质水平的上调或下调相关。此外，申请人发现miRNA分子可用于使翻译这些蛋白质的mRNAs的水平基本恢复正常。本发明涉及治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法和组合物。所述方法包括给受试者施用能够调节所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。所述组合物包括能够调节所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。因此，本发明涉及基于miRNA的组合物和基于miRNA的方法，所述组合物和方法能够使得暴露于相对高浓度葡萄糖的细胞中和患有暴露于血糖水平相关疾病的受试者细胞中，如糖尿病患者，包括糖尿病受试者的视网膜中被上调或下调的mRNA的表达水平和蛋白质的生成量基本恢复正常。本发明还涉及诊断方法，所述方法基于糖尿病相关疾病中miRNAs表达谱的差异。微小RNAmiRNAs与mRNAs的一部分或者一个或多个基因片段互补。而且，miRNAs与mRNA结合并不需要绝对的序列互补，使得它们能够调节范围广泛的靶转录物。通常miRNAs结合 到靶序列时，在相匹配的核苷酸之间有缝隙。此处使用的术语“绝对的序列互补”的意思是用来描述两段序列长度上的每个核苷酸对都能无缝隙的结合，比如一种miRNA和一种靶基因或转录物的结合。术语“互补”的意思是描述两段序列，其中至少有50%的核苷酸从一段序列反式结合到另一段序列上。miRNAs通常与mRNA转录物的:V UTR互补，然而，本发明中的miRNAs可以结合到靶mRNA的任何区域。或者说，此外，miRNAs靶向于响应编码靶mRNAs的基因的甲基化基因组位点。基因组DNA的甲基化状态部分决定了该DNA与转录因子结合的容易程度。因此，DNA的甲基化和去甲基化分别调节基因的沉默和表达。本发明的miRNAs包括表I中的序列(SEQ ID NOs. 1-6)及其同源体和类似物，miRNA的前体分子和编码所述miRNAs的DNA分子。表I
miRlSEQ ID NO. I
miR146a SEQ ID NO. 权利要求
1.一种治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给受试者施用一种能够调节所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分或成分的混合物。
2.权利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物能够上调所需受试者的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。
3.权利要求2的方法,其特征在于,所述一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA选自miR-1, miR-146a, miR200b 或者 miR-320。
4.权利要求2的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括一种寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。
5.权利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或类似物、miRNA前体、成熟miRNA或者编码所述至少一种miRNA的DNA分子的形式提供。
6.权利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以一种包括药学上可接受的载体的组合物的形式提供。
7.权利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物选自SEQIDNOs. 1-4。
8.权利要求4的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物以不超过一种给药载体的方式提供。
9.权利要求8的方法，其特征在于，所述给药载体选自病毒载体，微球，脂质体，胶体金颗粒，脂多糖，多肽，多糖，或聚乙二醇化的病毒载体。
10.权利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物能够下调所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。
11.权利要求10的方法,其特征在于,所述一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA选自 miR-1444 或者 miR-450。
12.权利要求10的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括所述至少一种miRNA的抑制剂或抑制剂的混合物。
13.权利要求11的方法，其特征在于，所述抑制剂或抑制剂的混合物选自antagomir、反义RNA或者短干扰RNA。
14.权利要求12的方法，其特征在于，所述抑制剂或抑制剂的混合物以一种包括药学上可接受的载体的组合物的形式提供。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病糖尿病大血管病变。
16.权利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物通过胃肠外给药途径或者局部给药途径施用。
17.权利要求15的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病视网膜病变，其中成分或成分的混合物通过眼内给药或者局部滴注到眼内的方式施用。
18.权利要求15的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病视网膜病变，其中成分或成分的混合物通过眼部植入的方式施用。
19.一种治疗受试者的糖尿病视网膜病变的方法，其特征在于，所述方法包括给受试者施用一种组合物，包括至少一种(a)祀向于miR-l,miR-146a,miR-200b或者miR-320的寡核苷酸，和(b)miR-144或者miR-450的抑制剂。
20.一种诊断受试者所患疾病的方法，所述疾病与葡萄糖介导的细胞损伤相关，其特征在于，所述方法包括检测受试者样本中的一种或多种miRNAs的表达谱,其中受试者样本的miRNA表达谱与正常样本或参考样本的miRNA表达谱的差异就是葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的指征。
21.权利要求20的诊断疾病的方法，其特征在于，所述一种或多种miRNAs选自miRl，miR146a, miR200b, miR320, miR144 或者 miR450。
22.权利要求21的诊断疾病的方法，其特征在于，与正常样本或者参考样本相比miRl，miR146a, miR200b和miR320的表达下调和miR144或者miR450的表达上调就是该疾病的指征。
23.根据权利要求20-22中任一项的诊断疾病的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病慢性并发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病或者糖尿病大血管病变。
24.一种治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的组合物，包括能够调节所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs的表达的一种成分或成分的混合物，和药学上可接受的载体。
25.权利要求24的组合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物能够上调所需的一种或多种细胞中的一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。
26.权利要求25的组合物，其特征在于，所述至少一种miRNA选自miR-1，miR-146a,miR200b 或者 miR-320。
27.权利要求25的组合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括一种寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。
28.权利要求27的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或类似物、miRNA前体、成熟miRNA或者编码所述至少一种miRNA的DNA分子的形式提供。
29.权利要求27的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物选自SEQID NOs. 1-4。
30.权利要求25的组合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物能够下调一种或多种miRNAs中的至少一种miRNA的表达。
31.权利要求30的组合物，其特征在于，一种或多种miRNAs中的至少一种选自miR-1444 或者 miR-450。
32.权利要求30的组合物，其特征在于，成分或成分的混合物包括所述的至少一种miRNA的抑制剂或抑制剂的混合物。
33.权利要求32的组合物,其特征在于,抑制剂或抑制剂的混合物选自antagomir、反义RNA或者短干扰RNA。
全文摘要
本发明涉及治疗受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，包括向所述受试者施用能够调节受试者的一种或多种损伤细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分。本发明还涉及治疗葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的组合物，包括能够调节一种或多种损伤细胞中的一种或多种miRNAs表达的成分。本发明还涉及诊断受试者的葡萄糖介导的细胞损伤相关疾病的方法，包括糖尿病视网膜病变的诊断。
文档编号A61K31/7088GK102970994SQ201080057925
公开日2013年3月13日 申请日期2010年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者萨巴瑞塔·切卡拉克巴蒂, 冯表, 陈莎莉, 吴月修, 卡拉·麦克阿瑟 申请人:昆山市工业技术研究院小核酸生物技术研究所有限责任公司