] 表2胆汁酸分析的质谱参数及校正采用内标
[0060]
[0061] 3、肠道菌群DNA测序
[0062]HiSeq2500测序，每个样本以350bp长度的片段建库与9.9M人类肠道基因集比 对。得到MG的门，种，属的生物谱系（with门水平是70%的覆盖率和65%识别率，属水平 有85%识别率，以及95%的种水平的识别率）。运用主成分分析的方法（PCA)对肠道寄生 菌聚类进行分析判断。
[0063] 本发明通过对患者粪便进行肠道微生物集落DNA抽提和宏基因组二代测序，并与 已发表的9. 9M人类肠道宏基因组基因集进行比对，比对率达到77%左右。运用聚类分析的 方法找到有注释信息的肠道微生物在用药前后有差异的大概143种。根据属水平的情况进 行分析的结果，发现2型糖尿病患者基线的肠道菌群有不同聚集的情况，据此根据特征性 肠道菌群聚集的情况，得到所谓肠型（Enterotype)。在本发明研究的对象中，主要发现两种 肠型一个普氏菌为主的普氏肠型，一个是拟杆菌为主的拟杆肠型（图1)。
[0064] 根据肠型分型后，两种类型的2型糖尿病患者，性别年龄分布并无显著差异。基线 血糖，体重以及各项肝肾功能等健康指标均无明显差异。仅红细胞，血红蛋白和白介6在普 氏肠型中略高（Ρ〈〇·〇5)。（表3)
[0065] 治疗后观察基线状态下两组人群对该药治疗糖尿病的疗效。
[0066] 首先，阿卡波糖最主要的疗效体现在餐后2小时血糖和糖化血红蛋的降低程度。 这两个指标并没有在两种肠型中体现出差异（图2,表4)
[0067] 第二，两种肠型在控制空腹血糖水平上出现了差异，无论是看治疗后较治疗前是 否改善，还是看治疗后相对治疗前的改善程度，均在拟杆肠型中显著；而普氏肠型的2型糖 尿病患者并无明显的空腹血糖改善。而其余代谢相关指标包括，胰岛素，体重，体重指数，腰 围，心血管风险因子以及肠道激素等，均有明显差异。
[0068] 空腹C肽和胰岛素水平均在拟杆肠型中在治疗后显著下降，经过计算，体现胰岛 素抵抗的H0MAIR指数在阿卡波糖治疗后下降，但这种受益仅在拟杆肠型中显著，而普氏肠 型中下降不显著。提示拟杆肠型的2型糖尿病患者更易在服用阿卡波糖后改善其胰岛素抵 抗的状态。与胰岛素抵抗相关而标准餐诱导的胰岛素释放曲线，腰臀比和Adiponectin水 平都是拟杆肠型肠型的T2DM患者接受拜糖平治疗后显著下降。在普氏肠型中这些疗效都 不显著。
[0069] 阿卡波糖带来血清甘油三酯，ΑΡ0Α和舒张压的降低，两个肠型中的治疗后变化并 无显著差异，然而TOGFAA和PDGFAABB，内皮素，VegfC等一些和糖尿病血管并发症相关的 血浆因子在拟杆肠型中下降显著，提示了有更好的降低血糖降低大血管病变风险以外，拟 杆肠型在应用阿卡波糖后亦能收获更多降低血管并发症的益处。
[0070] 肠道激素中作为最近2型糖尿病治疗领域中的热门靶点，其水平在阿卡波糖的应 用中也得到显著改变。在检测到的几个肠道激素中，用药后上升的GLPl，glUcag〇n，PYY，以 及各个时间点的ghrelin和GIP都在拟杆肠型中显著，但在普氏肠型中不显著。提示如果 阿卡波糖任何通过肠道激素所带来的代谢益处，可能都只在拟杆肠型中更为显著。
[0071] 第三，两种肠型在基线水平上就出现了胆汁酸谱的差异（图3A、B)。在拟杆肠型 中，次级胆汁酸中的脱氧胆酸和石胆酸水平显著低于普氏肠型，而有保护作用的熊脱氧胆 酸则高于普氏肠型。进一步肠道宏基因组分析，也发现熊去氧胆酸进一步降解成石胆酸的 K0明显在普氏肠型中富集（图3C)。提示两种肠型的患者，其肠道菌群代谢胆汁酸的能力有 显著差异。经过阿卡波糖治疗之后，胆汁酸组成差异在两种肠型中更为显著（图3D)。两种 初级胆汁酸在阿卡波糖治疗后在两种肠型中菌显著的升高，但并未出现肠型特异的变化， 提示阿卡波糖可能整体影响了胆汁酸在小肠的重吸收。
[0072] 因此，该研究显示，不同肠型可以预测患者接受阿卡波糖治疗糖尿病的受益，尤其 是降糖外改善胰岛素抵抗，降低次级胆汁酸，促进心血管风险降低的作用。肠型的诊断，可 以运用普通的DNAPCR扩增特征菌属的16sRNA即可完成，方便经济。为2型糖尿病的精准 医疗带来新的可能。
[0073] 表3两个肠型基线临床指标比较
[0074]
【主权项】
1. 一种肠道微生物宏基因特征在作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志物中的用途， 其特征在于，所述肠道微生物宏基因特征为拟杆菌属肠型。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述拟杆菌属肠型是通过对离体粪便中 的寄生菌的DNA进行测序或PCR扩增来确定的。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述PCR扩增具体包括：提取离体粪便中 寄生菌DNA，针对特异富集的菌属，进行16SrnaPCR扩增。4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述拟杆菌属肠型是通过检测离体血液 样本中的次级胆汁酸来确定的。5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述次级胆汁酸的检测包括如下步骤： 51、 样品预处理：每75μL血液样本，加入300μL含内标甲醇，提取目标化合物并沉淀 蛋白，涡旋、离心，吸取上清，冻干，用50μL含25% (体积）乙腈水溶液复溶，等待进样； 52、 检测：采用1290Infinity液相及6460Α三重四级杆质谱联用系统用于样品分析； 液相分离采用100mmX2. 1mmACQUITYUPLCC8色谱柱，粒径1. 7μπι，A相为10mM NH4HC03水溶液，B相为纯乙腈；初始时25% (体积）B相，保持0. 5分钟，随后在12. 5分钟 内线性升高到40% (体积）B相，接着，在lmin内升高到90% (体积）B相，并冲洗系统3 分钟，在0. 5分钟恢复到25 % (体积）B相，平衡2. 5分钟，流速为0. 35ml/min，柱温35°C， 进样体积5μL; 质谱采用ESI源负离子模式检测，主要参数如下：GasTemp:350°C;GasFlow:81/min; Nebulizer:40psi；SheathGasTemp:400°C；SheathGasFlow:81/min；Capillary:3500V； Nozzlevoltage:400V〇6. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，拟杆菌属肠型的2型糖尿病患者阿卡波糖 疗效包括降糖外改善胰岛素抵抗、降低次级胆汁酸、促进心血管风险降低。7. 根据权利要求6所述的用途其特征在于，所述降低次级胆汁酸的指标包括： ⑶CA，TDCA，TLCA，降低牛磺酸结合胆汁酸指标包括，TCA，TDCA，TLCA，TUDCA。8. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述改善胰岛素抵抗的指标包括空 腹血糖下降，空腹C肽和胰岛素水平的下降，腰臀比下调，H0MA胰岛素抵抗指数下调， Adiponectin上调。9. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述促进心血管风险降低的指标包括 PDGFAA、PDGFAABB、内皮素、VegfC血浆因子的下降。10. -种用于2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： 收集离体粪便样品或离体血液样品的试剂； 对离体粪便样品中的寄生菌的DNA进行测序或PCR扩增来确定肠型的试剂，或检测离 体血液样本中的次级胆汁酸来确定肠型的试剂。
【专利摘要】本发明公开了一种肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志；所述肠道微生物宏基因特征为拟杆菌属肠型。本发明首次运用肠型的概念发现了，具有不同肠道寄生菌群的2型糖尿病患者，对糖尿病降糖药物，阿卡波糖的治疗反应差别显著，因此，在用该药前，可以对患者进行肠型的分型，以选择最佳疗效人群，判别个体2型糖尿病患者是否适合运用阿卡波糖进行糖尿病治疗。此外，肠型惯常的分型是利用粪便中的寄生菌的DNA进行测序或PCR扩增，然而基线情况下胆汁酸组分，尤其是次级胆汁酸即能对肠型有良好的区分作用；可实现通过血中的标志物鉴定肠型，成为用于诊断的标志。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105296620
【申请号】CN201510703463
【发明人】宁光, 张东亚, 王卫庆, 王晓凯, 顾燕云, 冯强, 刘瑞欣, 徐晓强
【申请人】上海市内分泌代谢病研究所, 深圳华大基因研究院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月26日