专利名称：一种来自深海宏基因组的l-蛋氨酸裂解酶基因及其表达产物的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域和基因工程领域，涉及了一种来自深海环境的新基 因，尤其是一种来自深海宏基因组的能产生L-蛋氨酸Y -裂解酶活性的新基因，获得了新 基因的克隆，构建了工程大肠杆菌并获得表达产物。 L-蛋氨酸 γ-裂解酶(L-methionine γ-lyase，简称 MGL 或 METase)，是一种 5’ -磷酸吡哆醛(PLP)依赖型的多功能酶。它主要催化L-蛋氨酸的Y-消去反应，生成 甲硫醇、氨和α-丁酮酸，该酶还能催化L-半胱氨酸和硫代L-半胱氨酸的β-消去反应 以及L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸及它们的衍生物的Y，β -取代反应。MGL催化L-蛋氨酸 Y-消去的反应方程式(参见 Ilya V. Manukhov et. al. Journal of Bacteriology. 2005, 187 3889-3893)。 MGL主要在微生物中发现，包括细菌和某些原生动物。1951年首次在Escherichia coli中首次发现能够代谢L-蛋氨酸的酶，最初并命名为“蛋氨酸酶”(methionase)，随后
几十年间又陆续 艮道了从 Pseudomonas putida( = ovalis) > Clostridium sporogenes、 Aeromonas sp、 Citrobacter intermedius、 Brevibacteriumlinens、 Trichomonas vaginalis、Porphyromonas gingival is 细胃禾口 Hi t亥 · Entamoeba histolytica 禾口
Trichomonas vaginalis中发现了 MGL，其中的一些已经进行了酶的纯化和性质的测定 (Tomoaki Takakura et. al. AnalyticalBiochemistry 327 :233_240，2004 ；夏立亮等，生 物技术通报，10 :70-74，2009)。 近年来，在癌症治疗的新方法研究中发现，多种癌细胞生 长需要大量的L-蛋氨酸，即具有L-蛋氨酸依赖性(Hoffman RM & Erbe Rff. , Proc Natl Acad Sci USA, 73 1523-1527,1976) 通过输入外源MGL来消耗肿瘤组织的L-蛋氨酸， 使癌细胞不能分裂并停滞于细胞分裂期的S/G2后期，因此达到治疗的目的(HofTmanRM & Jacobsen SJ. Proc Natl Acad Sci USA 77 :7306_7310，1980 ；Kokkinakis DM. et. al. Br J Cancer 75 =779-788,1997)。研究还表明利用带有MGL基因的腺病毒载体转导癌细胞，导致 selenomethionine生成methylselenol，后者产生的氧化压力使细胞色素C释放而激活细 胞凋亡(K. Miki et al. Cancer Research 61 :6805_6810，2001)。 此外，MGL作为一个多功能酶，能够对多种底物起催化作用，并且因此作为一 种检测试剂在临床检测中具有重要意义；应用MGL检测各种环境中蛋氨酸和/或同
背景技术：
methanethiol (i-ketobutyrate ammonia
3型半胱氨酸含量的方法已经在美国授予专利(US Patent 5885767 (1999，3)-Methods and compositions for quantitating L-homocysteine and/orl-methionine in a solution) 在食品工业中MGL可以使蛋氨酸等成分直接产生甲硫醇类物质因而用于改 进食品风味(Fdlix Amarita. et. al. , Applied andEnvironmental Microbiology, 70 7348-7354,2004)。MGL还可以用于重要生化药物α-氨基丁酸的生物合成。由于蛋氨酸裂解酶具有重要应用前景，需要对该酶进行规模化制备。利用自然 分离的菌株或其突变株进行酶的制备，酶的产量极低，难以实现有效益的规模生产；目前 主要倾向应用基因工程的菌株进行酶的制备。Y. Tan等将来自Pseudomonas putida的 L-methionine α -deamino- y -mercaptomethane-lyase (艮口 METase 或 MGL)基因连接至丨J 含有T7RNA聚合酶启动子的表达载体pT7-7上，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达， 表达产物中重组MGL约占可溶性总蛋白的10% (Yuying Tan et. al. Protein Expression and Purification 9 :233_245，1997)。 Tomoaki Takakura ^ [=| Pseudomonas putida 的METase (即MGL)基因用含有trc启动子的载体构建成表达质粒pMGLTrc03，在大肠杆菌 JM109中表达，表达产物中重组METase占可溶性总蛋白的比例高达43% (TomoakiTakakura et. al. , Appl Microbiol Biotechnol, 70 183-192, 2006) 这些工作为该酶的研究和应用 提供酶的来源。在国内，马百坤、王红兵报道了将阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶基因克隆到大 肠杆菌的研究(马百坤，王红兵医学研究生学报，2008，21 (4) :353-359)，李朝辉和田长富 通过化学合成手段获得一个假单胞菌(Pseudomonas putida)的MGL酶基因，并初步试验其 在大肠杆菌表达(李朝辉，田长富昆明医学院学报，NO 6,157, 2009) 0阴道毛滴虫的MGL 酶和假单胞菌的MGL酶基因在国外也已经被克隆研究。本发明涉及的是一个来自深海宏基因组文库的基因，该基因最大的可能是来自 Idiomarina属的海洋细菌，该属细菌在2000年才由Ivanova等人发现并提出建立新属 (Ivanova, Ε. P. et al. Int. J. Syst. Evo 1. Microbiol. 50 (Pt2) :901_907，2000)，分子分类表 明该属微生物代表了明显不同的进化路线，2004年该属一个种I. Ioihiensis的基因组被 测定(Hou，S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 18036-18041，2004)，从基因组信息发 现该微生物的能量主要来源是氨基酸代谢而非一般微生物能量来源的糖代谢，这样该属微 生物具有明显特殊性。我们已经从深海宏基因组一个大片段克隆子中发现一个36Kb长的 深海DNA片段，测序表明所含35个阅读框(基因)的序列与已知的海洋细菌Idiomarina 相应基因有最高的相似性。该片段含有多个重要的氨基酸代谢有关基因，很多基因与已知 基因的相似性都较低，本申请涉及的基因mgl就是来自该克隆片段；海洋基因尤其来自深 海的基因往往与陆生生物的基因有较大差别。
发明内容
本发明的目的是提供了一种新的海洋L-蛋氨酸Y -裂解酶基因及其产物。本发明所述的一种来自深海宏基因组的L-蛋氨酸裂解酶基因，其核苷酸序列如 SEQ IDNO. 1所示。该基因的大小为1281bp。进一步，本发明提供了包含本发明所述的L-蛋氨酸裂解酶基因的重组表达载体。进一步，本发明提供了用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。优选地，所述的转化体为重组工程菌菌株E. coli Pmet，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO =M 209255。本发明还提供了由根据本发明所述的转化体表达的L-蛋氨酸裂解酶，其分子量 为46 46. 5kDa，序列推导的理论等电点为5. 28，催化L-蛋氨酸裂解的最适反应温度为 60°C，最适反应pH为9. 5。本发明所述的L-蛋氨酸裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，共426个氨基酸。本发明所述的L-蛋氨酸Y-裂解酶基因与已有报道的L-蛋氨酸Y-裂解酶基 因相比，区别在于本基因是从约2000米深海沉积物宏基因组fosmid文库中筛选得到 的，该基因序列经搜索比对国际数据库(NCBI)的结果显示与已知的海洋细菌Idiomarina loihiensis L2TR的相应基因有最高的一致性Identities = 786/1183 (66% )，但核苷酸 序列的差异达34% ；由该基因核苷酸序列翻译的氨基酸序列也与Idiomarina loihiensis L2TR或 Idiomarina baltica 的 MGL有最高一致性Identities = 264/391 (67% )，但氨基 酸序列差异达33%。因此，本发明提供了新的L-蛋氨酸Y-裂解酶基因以及相应的L-蛋 氨酸Y-裂解酶蛋白。本发明首先从南海约2000米深海沉积物提取制备总DNA，然后用该DNA以及 fosmid载体和大肠杆菌构建了宏基因组文库，从文库数万个克隆子中挑选一个约含36kb 外源DNA片段的克隆子进行测序研究，应用GeneMark hmm2. 4程序在线对其序列进行分析 预测，该克隆子含35个完整的0RF(开放阅读框)和2个不完整的0RF。在该克隆子序列 分析中发现了一个与L-蛋氨酸Y-裂解酶基因最相似的基因(称mgl)，将该基因连接到 原核表达载体PET 32a并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得了转化体，所得转化体能产 生过量的重组蛋白，该蛋白产物能分解L-蛋氨酸，产生丁酮酸等产物，即具有L-蛋氨酸 Y-裂解酶活性。本发明所得的含mgl基因的转化体菌株命名为E coli Pmet(保藏号为 CCTCC NO =M 209255)。经用NCBI网站的BLASTX工具比对，所克隆的mgl基因与海洋细菌 Idiomarina loihiensis L2TR 的 L-蛋氨酸 Y -裂解酶(Methioninegamma-Iyase)的基因 序列有最高的一致性(66% )。鉴于原始克隆的36kb片段中的绝大部分基因序列(88% ) 也都与Idiomarina属基因具有最高相似性，因此推断本发明所克隆的基因mgl最有可能来 源于Idiomarina属海洋细菌，或者来自未被报道相关基因的其它与Idiomarina属相近的 微生物。本发明还提供了所述的L-蛋氨酸裂解酶的制备方法，包括以下步骤培养用包含 如权利要求3所述的转化体，诱导表达并回收所表达的具有催化L-蛋氨酸裂解活性的蛋 白产物。优选地，所述的制备方法中，诱导表达时，诱导温度为20°C ；诱导剂为IPTG，其终浓 度为0. ImM ；诱导时间为14小时。本发明获得的具有催化L-蛋氨酸裂解活性的蛋白产物，其特征是分子量(单 体)为461^^，催化蛋氨酸裂解反应的最适温度为601，最适反应？!1为9.5。综合各种特 征，该蛋白与已报道的L-蛋氨酸-γ -裂解酶有明显不同(表1)。表1.不同来源蛋氨酸-Y-裂解酶的比较*
权利要求
一种来自深海宏基因组的L 蛋氨酸裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.包含如权利要求1所述的基因的重组表达载体。
3.用如权利要求2所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。
4.根据权利要求3所述的转化体，为重组工程菌菌株E.coli Pmet，保存于中国典型培 养物保藏中心，保减号为CCTCC NO =M 209255。
5.由根据权利要求3所述的转化体表达的L-蛋氨酸裂解酶，其分子量为46 46. 5kDa，序列推导的理论等电点为5. 28，催化L-蛋氨酸裂解的最适反应温度为60°C，最适 反应pH为9. 5。
6.根据权利要求5所述的L-蛋氨酸裂解酶，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
7.如权利要求5所述的L-蛋氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤培 养用包含如权利要求3所述的转化体，诱导表达并回收所表达的具有催化L-蛋氨酸裂解活 性的蛋白产物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于诱导表达时，诱导温度为20°C；诱导 剂为IPTG，其终浓度为0. ImM ；诱导时间为14小时。
9.根据权利要求5所述的L-蛋氨酸裂解酶的用途，包括用于制备治疗癌症的药物的应用；用于制备检测环境中蛋氨酸和/或同型半胱氨酸含量的检测试剂的应用；用于制备改进食品风味的制试剂的应用；以及用于合成α-氨基丁酸的应用。
全文摘要
本发明涉及一种来自深海环境的新基因，尤其是一种来自深海宏基因组的能产生L-蛋氨酸γ-裂解酶活性的新基因，获得了新基因的克隆，构建了工程大肠杆菌并获得表达产物。本发明所述的一种来自深海宏基因组的L-蛋氨酸裂解酶基因，该基因大小为1281bp，序列如SEQ ID NO.1所示，编码426个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示；蛋白分子量为46.024kDa，等电点为5.28。本发明首次克隆得到了深海L-蛋氨酸γ-裂解酶基因，并首次分析了其产物及摸索出重组基因工程大量制备该酶蛋白的方法，能获得足够用于产业应用的酶蛋白。
文档编号C12N15/60GK101962651SQ201010109028
公开日2011年2月2日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者周世宁, 李慧贤, 陆勇军, 黄雅丽 申请人:中山大学