专利名称：蛹虫草退化菌种快速鉴定方法
技术领域：
本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法。
背景技术：
蛹虫草(Cordyc印s militaris (L. ) Link)又称为北虫草，属于子囊菌门Ascomycota、子囊菌纟冈Ascomycetes、肉座菌目Hyocreales、麦角菌禾斗Clavicipitaceae、虫草属Cordyc印s。蛹虫草广布世界各地，我国各省都有分布。 与蛹虫草同属的冬虫夏草(C. sinensis (Berk.) Sacc.)是传统的中药资源，具有保健和药用价值，特别是抗肿瘤的功效。蛹虫草的药理和毒理等方面研究已表明，蛹虫草的营养成分和药用价值与冬虫夏草相似，可作为冬虫夏草的代用品(徐锦堂，1997)。由于近年来冬虫夏草的资源短缺、价格昂贵，蛹虫草渐受到消费者的青睐，市场需求旺盛。在自然资源难以满足需求的情况下，蛹虫草的人工栽培是解决这一需求的最佳选择。
目前，蛹虫草批量生产中的核心技术难题是菌种的严重退化。菌种经传代2 3次后，生产性能会明显变化。经分离得到的优良菌种，一般使用半年也会发生退化。菌种退化是不可逆而且可遗传的，因此给蛹虫草的批量生产带来极大的风险(Li et al. 1994;Horgen et al. 1996 ;Ryan et al. 2003)。解决蛹虫草的菌种退化问题已成为国内外学者研究的焦点。 菌种退化是菌类栽培中普遍存在的现象。退化食用菌的表型为子实体原基减少，产孢能力大幅度上升或下降，培养周期变长，甚至子实体生长受阻(丁湖广，2006)。为解决蛹虫草的退化问题，公告号为CN1094091的专利公开通过常规单孢或多孢分离方法，蛹虫草原始菌株经过母种、原种、栽培种的三次筛选，获得优良菌种；公告号为CN1710063的专利公开通过将子实体内部组织接种到高效PDA培养基上培养获得候选菌株，然后栽培试验，鉴别菌种生产性能以筛选出优良菌种；公告号为CN101353628的专利公开通过挑选草牙金黄色、长势健壮、菌丝整齐、菌落淡黄色的菌株作为可育的优良菌株。上述现有技术都是通过后期的大量栽培试验而获得优良菌种，因此周期较长，速度较慢，且要花费很多原料。 至今，针对菌种退化问题，主要尝试过以下解决方法(l)优化培养基，改进栽培条件；(2)尽量减少转代次数；(3)菌种复壮。但这些措施未能从根本上解决菌种的退化问题。菌种退化可能涉及一系列极其复杂的生理、生化和遗传过程。退化菌株与正常菌株相比，其生理生化过程、分子水平和遗传性状都可能表现出极大差异。
发明内容
本发明的目的是提供了一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法。 本发明是根据蛹虫草的正常菌种和退化菌种两者对合成染料脱色能力的差异，将指示剂溴麝香草酚蓝添加到培养基，利用颜色变化或/和脱色率区分退化菌种与正常菌种，从而实现了本发明的目的。
本发明的蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，包括以下步骤 a)将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养，然后将获得的一级菌种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养，得到蛹虫草二级液体菌种，经过滤获得蛹虫草的孢子液； b)将a)步骤获得孢子液转接到色度培养基中，使每毫升色度培养基中含有孢子1 X 103 1 X 106个，然后在常规培养条件下振荡培养； c)8_15天后，取出孢子培养液，观察孢子培养液的颜色，当孢子培养液的颜色为蓝色或者绿色时，判断该蛹虫草菌种为退化菌种。 所述的色度培养基的组分如下按质量分数100%计，酵母粉0.45%、细菌蛋白胨
0. 75%、乳糖0. 5%、溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025%。、余量为水。 本发明还提供了另一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，包括以下步骤 a)将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养，然后将获得的一
级菌种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养，得到蛹虫草二级液体菌种，经过滤获
得蛹虫草的孢子液； b)将a)步骤获得孢子液转接到色度培养基中，使每毫升色度培养基中含有孢子1 X 103 1 X 106个，然后在常规培养条件下振荡培养，按上述孢子液与其接入的色度培养基的体积比将液体PDA培养基接入到色度培养基内，同等条件下进行培养作为对照液；
c)8-15天后，取出孢子培养液和对照液，然后将孢子培养液和对照液离心去除菌丝和孢子，取上清液，测定两种上清液的OD^，用公式计算菌种的脱色率D = [l-(孢子培养液的上清液0D615/对照液的上清液0D615) ] X 100% ，当脱色率D < 20时，判断该蛹虫草菌种为退化菌种； 所述的色度培养基的组分如下按质量分数100%计，酵母粉0.45%、细菌蛋白胨0. 75%、乳糖0. 5%、溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025%。、余量为水。 上述两种方法都是应用蛹虫草的正常菌种和退化菌种两者对溴麝香草酚蓝脱色能力的差异，将指示剂溴麝香草酚蓝添加到培养基，培养菌种，菌株对溴麝香草酚蓝进行脱色，8-15天后，表观为颜色的直接变化或者与同等条件下的培养基相对照的脱色率变化，颜色的变化和脱色率的变化，这两个指标都是对菌种脱色能力的外在表观，因此其构思是相同。如果经过上述方法测定后，当其颜色为黄色或者脱色率大于20时，则判断该菌种为正常菌种。 上述两种方法中，所述的b)步骤优选是先用液体PDA培养基将a)步骤获得孢子
液稀释至浓度为1 X 105 1 X 108个/mL，然后再接入到色度培养基中。 上述两种方法中，所述的一级菌种活化培养可以采用一般的公知方法，优选方法
是将分离纯化的蛹虫草菌种接种至经灭菌的固体斜面PDA培养基，20 25t:，避光培养
7 IO天，至白色绒毛状菌丝长满斜面，获得一级菌种。 上述两种方法中，所述的二级液体培养可以采用一般的公知方法，优选方法是将一级菌种从平板上接种至经灭菌的液体PDA培养基中，常规条件下振荡培养5 7天，至菌球充满液体培养基，获得二级液体菌种。 本发明的PDA液体和固体培养基是本领域公知技术中的培养基。 所述的酵母粉、细菌蛋白胨、溴麝香草酚蓝(BTB)和乳糖都属于现有技术的产品。
所述的色度培养基的配置方法如下称量酵母粉4. 5g，细菌蛋白胨7. 5g，乳糖5g，
溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025g，加水至lOOOmL，经高压蒸汽灭菌，冷却至室温待用。 本发明根据正常菌种和退化菌种对溴麝香草酚蓝脱色能力的差异，利用颜色变化
或者脱色率区分退化菌株与正常菌株。该方法具有快速、简单、成本低的优点，能够准确的
鉴别出退化菌株和正常菌株，从而可以在蛹虫草人工栽培前进行快速鉴定，筛选出正常菌
株进行栽培，达到节约成本的目的。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1 按质量分数100%计，含有马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，琼脂1.8%，余量为水，按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。 按质量分数100%计，含有马铃署20%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0. 2%，硫酸镁0. 1 % ，维生素B口Omg/L，余量为水，按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g，细菌蛋白胨7.5g，溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025g，乳糖5g，余量为水，按照上述配方制得色度培养基。 将分离纯化的蛹虫草菌株Mll接种至灭菌的固体斜面PDA培养基，2(TC，避光培养10天，至白色绒毛状菌丝长满斜面，然后将该一级菌种从平板接至经灭菌的液体PDA培养基中，25t:、120r/min条件下振荡培养7天，至菌球充满液体培养基。 将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(10X15cm，杭州新华纸业有限公司)过滤得到孢子液，用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为1 X 108个/mL。将300 y L孢子液接到30mL色度培养基，25°C 、 120r/min条件下振荡培养，以加入300 y L液体PDA培养基到30mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。8天后，取出孢子培养液和对照液，经12000r/m离心15min，去除菌丝和孢子，吸取两者的上清液，以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零，测定两种上清液的0D615。 用公式计算菌株Mll的脱色率D = [1-(孢子培养液的上清液00615/对照液的上清液OD服)]XIOO。 通过上述检测，菌株Mil的孢子培养液颜色为黄色，脱色率为104。
因此，可判断蛹虫草菌株Mll为正常菌株。
菌株M11的栽培试验 将上述的Mll 二级菌种转接到大米培养基，在18 23t:、湿度为65 90%、温度为85X、光照强度为200-6001ux、适当通气和光照下(12h/d)常规人工培养，55天后形成正
常的子实体。
实施例2 : 按质量分数100%计，含有马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，琼脂1.8%，余量为水，按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。 按质量分数100%计，含有马铃署20%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0. 2%，硫酸镁
0. 1 % ，维生素B口Omg/L，余量为水，按照上述配方制得液体PDA培养基。 每升色度培养基中含有酵母粉4.5g，细菌蛋白胨7.5g，溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025g，乳糖5g，余量为水，按照上述配方制得色度培养基。 将分离纯化的蛹虫草菌株M4接种至灭菌的固体斜面PDA培养基，22°C ，避光培养9天，至白色绒毛状菌丝长满斜面，然后将一级菌种从平板接至经灭菌的液体PDA培养基中，25°C、120r/min条件下振荡培养6天，至菌球充满液体培养基。 将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(同实施例1)过滤，得到孢子液，用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为1 X 107个/mL。将250 y L孢子液接到25mL色度培养基，25°C 、120r/min条件下振荡培养，以加入250 y L液体PDA培养基到25mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。10天后，取出孢子培养液和对照液，经12000r/m离心15min，去除菌丝和孢子，吸取两者的上清液，以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零，测定两种上清液的OD服。 用公式计算菌株M4的脱色率D = [1-(孢子培养液的上清液00615/对照液的上清液OD服)]XIOO。 通过上述检测，菌株M4的孢子培养液颜色为黄色，脱色率为32。
因此，可判断蛹虫草菌株M4为正常菌株。
菌株M4的栽培试验 将上述的M4 二级菌种转接到大米培养基，在18 23t:、湿度为65 90%、温度为85X、光照强度为200-6001ux、适当通气和光照下(12h/d)常规人工培养，60天后形成正
常的子实体。
实施例3 : 按质量分数100%计，含有马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，琼脂1.8%，余量为水，按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。 按质量分数100%计，含有马铃署20%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0. 2%，硫酸镁0. 1 % ，维生素B口Omg/L，余量为水，按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g，细菌蛋白胨7.5g，溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025g，乳糖5g，余量为水，按照上述配方制得色度培养基。 将分离纯化的蛹虫草菌株M6接种至灭菌的固体斜面PDA培养基，23°C ，避光培养8天，至白色绒毛状菌丝长满斜面，然后将一级菌种从平板接至经灭菌的液体PDA培养基中，25°C、120r/min条件下振荡培养6天，至菌球充满液体培养基。 将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(同实施例1)过滤，得到孢子液，用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为1 X 106个/mL。将300 ii L孢子液接到30mL色度培养基，25°C 、120r/min条件下振荡培养，以加入300 y L液体PDA培养基到30mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。12天后，取出孢子培养液和对照液，经12000r/m离心15min，去除菌丝和孢子，吸取两者的上清液，以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零，测定两种上清液的0D615。 用公式计算菌株M6的脱色率D = [1-(孢子培养液的上清液00615/对照液的上清液OD服)]XIOO。 通过上述检测，菌株M6的孢子培养液颜色为绿色，脱色率为15。因此，可判断蛹虫草菌株M6为退化菌株。
菌株M6的栽培试验
将上述的M6 二级菌种转接到大米培养基，在18 23t:、湿度为65 90%、温度为85X、光照强度为200-6001ux、适当通气和光照下(12h/d)人工培养，72天后没有形成正
常的子实体。
实施例4 : 按质量分数100%计，含有马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，琼脂1.8%，余量为水，按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。 按质量分数100%计，含有马铃署20%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0. 2%，硫酸镁0. 1 % ，维生素B口Omg/L，余量为水，按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g，细菌蛋白胨7.5g，溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025g，乳糖5g，余量为水，按照上述配方制得色度培养基。 将分离纯化的蛹虫草菌株M5接种至灭菌的固体斜面PDA培养基，24°C ，避光培养7天，至白色绒毛状菌丝长满斜面，然后将该一级菌种从平板接至经灭菌的液体PDA培养基中，25t:、120r/min条件下振荡培养5天，至菌球充满液体培养基。 将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(同实施例1)过滤，得到孢子液，用液体PDA
培养基将孢子液浓度稀释为5 X 105个/mL。将400 y L孢子液接到40mL色度培养基，25°C 、
120r/min条件下振荡培养，以加入400 y L液体PDA培养基到40mL色度培养基进行同等条
件培养作为对照液。14天后，取出孢子培养液和对照液，经12000r/m离心15min，吸取两者
的上清液，以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零，测定两种上清液的0D615。 用公式计算菌株M5的脱色率D = [1-(孢子培养液的上清液00615/对照液的上清
液OD服)]XIOO。 通过上述检测，菌株M5的孢子培养液颜色为蓝色，脱色率为-46。因此，可判断蛹虫草菌株M5为退化菌株。
菌株M5的栽培试验 将上述的M5 二级菌种转接到大米培养基，在18 23t:、湿度为65 90%、温度为85X、光照强度为200-6001ux、适当通气和光照下(12h/d)常规人工培养，70天后没有形
成正常的子实体。
实施例5 : 按质量分数100%计，含有马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，琼脂1.8%，余量为水，按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。 按质量分数100%计，含有马铃署20%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0. 2%，硫酸镁0. 1 % ，维生素B工20mg/L，余量为水，按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g，细菌蛋白胨7.5g，溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025g，乳糖5g，余量为水，按照上述配方制得色度培养基。 将分离纯化的蛹虫草菌株M8接种至灭菌的固体斜面PDA培养基，25°C ，避光培养7天，至白色绒毛状菌丝长满斜面，然后将一级菌种从平板接至经灭菌的二级菌种的液体PDA培养基中，25t:、120r/min条件下振荡培养5天，至菌球充满液体培养基。
将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(同实施例1)过滤，得到孢子液，用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为1 X 105个/mL。将500 ii L孢子液接到50mL色度培养基，25°C 、120r/min条件下振荡培养，以加入500 y L液体PDA培养基到50mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。15天后，取出孢子培养液和对照液，经12000r/m离心15min，吸取两者
的上清液，以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零，测定两种上清液的0D615。 用公式计算菌株M8的脱色率D = [1-(孢子培养液的上清液00615/对照液的上清
液0D服)]X100。 通过上述检测，菌株M8的孢子培养液颜色为蓝色，脱色率为-123。因此，可判断蛹虫草菌株M8为退化菌株。
菌株M8的栽培试验 将上述的M8 二级菌种转接到大米培养基，在18 23t:、湿度为65 90%、温度为85X、光照强度为200-6001ux、适当通气和光照下(12h/d)人工培养，65天后没有形成正常的子实体。
权利要求
一种蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Link)退化菌种快速鉴定方法，其特征在于包括以下步骤a)将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养，然后将获得的一级菌种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养，得到蛹虫草二级液体菌种，经过滤获得蛹虫草的孢子液；b)将a)步骤获得孢子液转接到色度培养基中，使每毫升色度培养基中含有孢子1×103～1×106个，然后在常规培养条件下振荡培养；c)8-15天后，取出孢子培养液，观察孢子培养液的颜色，当孢子培养液的颜色为蓝色或者绿色时，判断该蛹虫草菌种为退化菌种；所述的色度培养基的组分如下按质量分数100％计，酵母粉0.45％、细菌蛋白胨0.75％、乳糖0.5％、溴麝香草酚蓝(BTB)0.025‰、余量为水。
2. 根据权利要求l所述的蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，其特征在于所述的b)步骤 为先用液体PDA培养基将a)步骤获得孢子液稀释至浓度为1 X 105 1 X 108个/mL，然后 再接入到色度培养基中。
3. 根据权利要求1或2所述的蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，其特征在于所述的一 级菌种活化培养是将分离纯化的蛹虫草菌种接种至经灭菌的固体斜面PDA培养基，20 25t:，避光培养7 IO天，至白色绒毛状菌丝长满斜面，获得一级菌种；所述的二级液体培 养是将一级菌种从平板上接种至经灭菌的液体PDA培养基中，常规条件下振荡培养5 7 天，至菌球充满液体培养基，获得二级液体菌种。
4. 一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，其特征在于包括以下步骤a) 将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养，然后将获得的一级菌 种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养，得到蛹虫草二级液体菌种，经过滤获得蛹 虫草的孢子液；b) 将a)步骤获得孢子液转接到色度培养基中，使每毫升色度培养基中含有孢子 1 X 103 1 X 106个，然后在常规培养条件下振荡培养，按上述孢子液与其接入的色度培养 基的体积比将液体PDA培养基接入到色度培养基内，同等条件下进行培养作为对照液；c) 8-15天后，取出孢子培养液和对照液，然后将孢子培养液和对照液离心去除菌丝和 孢子，取上清液，测定两种上清液的OD^，用公式计算菌种的脱色率D = [l-(孢子培养液的 上清液0D615/对照液的上清液0D615) ] X 100% ，当脱色率D < 20时，判断该蛹虫草菌种为退 化菌种；所述的色度培养基的组分如下按质量分数100%计，酵母粉0. 45%、细菌蛋白胨 0. 75%、乳糖0. 5%、溴麝香草酚蓝(BTB)O. 025%。、余量为水。
5. 根据权利要求4所述的蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，其特征在于所述的b)步骤 为先用液体PDA培养基将a)步骤获得孢子液稀释至浓度为1 X 105 1 X 108个/mL，然后 再接入到色度培养基中。
6. 根据权利要求4或5所述的蛹虫草退化菌种快速鉴定方法，其特征在于所述的一 级菌种活化培养是将分离纯化的蛹虫草菌种接种至经灭菌的固体斜面PDA培养基，20 25t:，避光培养7 10天，至白色绒毛状菌丝长满斜面，获得一级菌种；所述的二级液体培 养是将一级菌种从平板上接种至经灭菌的液体PDA培养基中，常规条件下振荡培养5 7天，至菌球充满液体培养基，获得二级液体菌种'
全文摘要
本发明公开了一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法。它包括以下步骤a)将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养，然后将获得的一级菌种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养，得到蛹虫草二级液体菌种，经过滤获得蛹虫草的孢子液；b)将a)步骤获得孢子液转接到色度培养基中，使每毫升色度培养基中含有孢子1×103～1×106个，然后在常规培养条件下振荡培养；c)8-15天后，取出孢子培养液，观察孢子培养液的颜色，当孢子培养液的颜色为蓝色或者绿色时，判断该蛹虫草菌种为退化菌种。该方法具有快速、简单、成本低的优点，能够准确的鉴别出退化菌株和正常菌株，从而可以在蛹虫草人工栽培前进行快速鉴定。
文档编号C12Q1/04GK101775433SQ20101010875
公开日2010年7月14日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者丘雪红, 林清泉, 韩日畴 申请人:广东省昆虫研究所