呕吐毒素的电化学检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种呕吐毒素的电化学检测方法，包括如下步骤：1)在玻碳电极上修饰单壁碳纳米管/壳聚糖复合物，晾干；2)抗原DON?BSA连接到玻碳电极上：将电极用磷酸盐缓冲液冲洗，浸泡于EDC和NHS的混合溶液中，孵育，磷酸盐缓冲液冲洗，将牛血清白蛋白?呕吐毒素偶联抗原滴涂于电极表面，孵育，冲洗，用牛血清白蛋白溶液封闭剩余活性位点；3)测定待测样品中的呕吐毒素含量：将过量的呕吐毒素抗体和待测样品溶液混合，滴加在玻碳电极表面，孵育，冲洗，加入碱性磷酸酶标记的二抗，孵育，冲洗，测定电化学信号，计算得到结果。本方法检测灵敏度高、检测范围宽、快速的、能够检测到超低含量呕吐毒素。
【专利说明】
呕吐毒素的电化学检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于电化学检测技术领域，具体涉及一种呕吐毒素的电化学检测方法。
【背景技术】
[0002] 呕吐毒素(vomi toxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(D0N)，化学名为3a，7a，15-三羟 基草镰孢菌-9-烯-8-酮，分子量为296.3，分子式为C 15H2Q06，结晶为无色针状，熔点为151~ 153°C，a，0-不饱和酮基致使其在短波紫外下有吸收峰，是单端孢霉烯族化合物的一种，为 一种倍半烯衍生物，由于它可以引起猪的呕吐而得名。它通常是由生长在谷类物品（如小 麦、玉米、大麦和秣草)霉菌镰红菌素生成的。但此紫外吸收与其它许多物质紫外吸收相重 叠，并非特征性的。DON耐热、耐压，弱酸中不分解，加碱及高压处理可以破坏其部分毒力。 DON的耐藏力也很强。据报道病麦经4年的贮藏，其中的DON仍能保留原有的毒性。
[0003] DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人 和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应，欧盟分类标准为三级致 癌物。另外，它还常与其它的霉卤毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互 影响。近年来发现DON可能与人类食管癌、IgA肾病有关，对人类及动物的健康构成威胁。DON 属于剧毒或中等毒物，研究表明，DON在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很 强的细胞毒性。人畜摄入了被DON污染的食物/饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立 不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，但不同的动物对DON的敏 感程度不一，猪是最敏感的动物。研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和 一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于DON的危害严重，引起了各国 的普遍重视。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。
[0004] 目前呕吐毒素的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相 色谱法(GC)、T红外光谱分析方法(IR)、酶联免疫吸附试验(ELISA) JLC虽然操作简单，但是 该方法处理样品工作量大，需要大量使用有机溶剂，对操作人员和环境都会有不利影响； HPLC、GC和IR具有自动化高、高检测效能，能对呕吐毒素进行定性定量分析，但是设备价格 昂贵，前处理复杂，不便于推广应用;ELISA具有快速、灵敏、可定量、操作简便、对样品纯度 要求不高、特异性强等特点，但是反应试剂需低温保存，否则会导致结果不够准确，且结果 的重复性易受操作过程影响，此外该方法检测时间较长。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对以上问题提供一种检测灵敏度高、检测范围宽、快速的、能够 检测到超低含量呕吐毒素的电化学检测方法。
[0006] 为实现上述目的所采用的技术方案是：一种呕吐毒素的电化学检测方法，包括如 下步骤：
[0007] 1)在玻碳电极上修饰单壁碳纳米管/壳聚糖复合物:将玻碳电极抛光打磨，超纯水 清洗，接着用丙酮和硝酸混合液清洗，再用超纯水冲洗，晾干，将单壁碳纳米管/壳聚糖分散 液滴涂于电极表面，晾干；
[0008] 2)抗原D0N-BSA连接到玻碳电极上:将步骤1)晾干的电极用磷酸盐缓冲溶液冲洗， 浸泡于EDC和NHS的混合溶液中，33~40°C孵育50~70分钟，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗玻 碳电极，立即将牛血清白蛋白-呕吐毒素偶联抗原滴涂于电极表面，33~40°C孵育50~70分 钟，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，用牛血清白蛋白溶液孵育封闭剩余的活性位点；
[0009] 3)测定待测样品中的呕吐毒素含量：将过量的呕吐毒素抗体和待测样品溶液混 合，滴加在步骤2)处理过后的玻碳电极表面，33~40°C孵育75~100分钟，用磷酸盐缓冲溶 液冲洗，加入碱性磷酸酶标记的二抗，33~40°C孵育75~100分钟，磷酸盐缓冲溶液冲洗，进 行差分脉冲伏安扫描，测定碱性磷酸酶标记的二抗电化学信号，根据标准曲线即可得到待 测样品中的呕吐毒素含量。
[0010] 在上述技术方案中，所述步骤3)中的标准曲线获得方法为:将过量的呕吐毒素抗 体和含不同浓度呕吐毒素的标液分别混合得到不同混合液，分别将混合液滴加在前述步骤 2)处理过后的玻碳电极表面，33~40 °C孵育75~100分钟，磷酸盐缓冲溶液冲洗，加入碱性 磷酸酶标记的二抗，33~40 °C孵育75~100分钟，磷酸盐缓冲溶液冲洗后于含0.75mg/mLa-磷酸萘酯的二乙醇胺溶液中进行差分脉冲伏安扫描，测定碱性磷酸酶标记的二抗电化学信 号，采用线性回归法得到呕吐毒素含量测定标准曲线。
[0011] 作为优选地，所述步骤1)中玻碳电极的直径为3mm，所述玻碳电极的抛光打磨用直 径为0 ? 05mi的Al2〇3抛光粉打磨。
[0012] 作为优选地，所述步骤1)中单壁碳纳米管/壳聚糖分散液中单壁碳纳米管/壳聚糖 复合物的浓度为lmg/mL，使用量2yL。
[0013]作为优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为〇 ? 01m〇l/L，pH为7 ? 4。
[0014] 作为优选地，所述步骤2)中EDC和NHS的混合溶液使用量为50此，其中含5mmol/L EDC、2mmo 1 /L NHS;牛血清白蛋白-呕吐毒素偶联抗原浓度为1 Oyg/mL，使用量为1 OyL。
[0015]作为优选地，所述步骤3)中玻碳电极在含0.75mg/mLa-磷酸萘酯的二乙醇胺溶液 中进行差分脉冲伏安扫描。
[0016] 作为优选地，所述丙酮和硝酸混合液为丙酮和硝酸按体积比1:1混合得到。
[0017] 本发明的有益效果是:首次利用单壁碳纳米管/壳聚糖修饰的电化学免疫传感器 对呕吐毒素进行电化学检测，可以实现对超低含量呕吐毒素的检测，检出限为5pg/mL，线性 范围为10pg/mL~1000ng/mL。本方法检测灵敏度极高、检测线性范围广、操作简单、特异性 强、检测快速、结果准确，而且所需设备简易、检测成本低，具有极大的实际应用价值。
【附图说明】
[0018]图1是本发明方法原理示意图。
[0019] 图2是单壁碳纳米管/壳聚糖修饰的电化学免疫传感器的DPV曲线图；呕吐毒素浓 度分别为：（a)0,（b)10pg/mL，（c)100pg/mL，（d)500pg/mL，（e)lng/mL，（f)10ng/mL，（g) 100ng/mL，（h)1000ng/mL。
[0020] 图3是本发明方法的呕吐毒素与电流信号线性关系图。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022] 主要试剂及生产者：
[0023] 单壁碳纳米管:深圳市纳米港有限公司（中国）
[0024]呕吐毒素标准溶液、壳聚糖、牛血清白蛋白、3-二甲基氨基丙基亚胺、N-羟基琥珀 酰亚胺、碱性磷酸酶标记的二抗、a_磷酸萘酯:Sigma-Aldrich公司（美国）
[0025] 牛血清白蛋白-呕吐毒素偶联抗原、呕吐毒素抗体:北京华安麦科生物技术有限公 司（中国）
[0026] 实施例1电化学方法检测呕吐毒素
[0027]本方法原理图如图1所示。检测按照如下步骤操作：
[0028] 1)在玻碳电极上修饰单壁碳纳米管/壳聚糖复合物:将直径为3mm的玻碳电极用直 径为0.05wii的Al2〇3抛光粉打磨，再用超纯水超声清洗5分钟。接着用体积比1:1的丙酮和硝 酸混合液超声清洗5分钟，再用超纯水冲洗干净。待室温下晾干后，将2yL lmg/mL单壁碳纳 米管/壳聚糖分散液滴涂于清洗干净的电极表面，室温下自然晾干，使分散液与玻碳电极充 分接触。单壁碳纳米管/壳聚糖分散液配制方法:将5mg单壁碳纳米管粉末加入5mL lmg/mL 的壳聚糖溶液中，超声2小时以获取均匀混合物，使用前保存于4°C。
[0029] 2)抗原D0N-BSA连接到玻碳电极上:将步骤1)中用单壁碳纳米管/壳聚糖复合物修 饰过的电极用0. 〇lmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，浸泡于50yL含5mmol/L 3-二 甲基氨基丙基亚胺(EDC)和2mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中，在37°C烘箱中 孵育1小时以活化单壁碳纳米管上的羧基基团。然后用0.01111 〇1/1411为7.4的磷酸盐缓冲溶 液冲洗玻碳电极，立即将1〇此10yg/mL牛血清白蛋白-呕吐毒素偶联抗原(抗原D0N-BSA)滴 涂于电极表面，在37 °C烘箱中孵育1小时。然后用0.0 lmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲 洗后，室温下用1〇此5mg/mL牛血清白蛋白（BSA)溶液进一步孵育30分钟，以封闭剩余的活 性位点。抗原D0N-BSA通过蛋白质氨基端与壳聚糖修饰的单壁碳纳米管上的活化羧基反应 连接。
[0030] 3)绘制标准曲线:将5此呕吐毒素抗体(将成品按体积比1:150稀释)和5此含8种不 同浓度呕吐毒素的标液（用磷酸盐缓冲溶液配制)分别混合得到8份混合液，呕吐毒素标液 的8种浓度为：0，10pg/mL，100pg/mL，500pg/mL, lng/mL, 10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。分 别将8份混合液滴加在步骤2)处理过后的玻碳电极表面，在37 °C烘箱中孵育90分钟。然后用 0.0 lmo 1 /L，pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗，加入10yL碱性磷酸酶标记的二抗(将成品按体 积比1:200稀释），在37°C烘箱中孵育90分钟。用0.01m 〇l/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗 后于含0.75mg/mLa-磷酸萘酯（a-NP)的二乙醇胺(DEA)溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫 描，测定碱性磷酸酶标记的二抗电化学信号（如图2所示）。以ip对呕吐毒素浓度(C)作图可 得ip-C工作曲线。采用线性回归法得到ip-C线性回归方程 7 = 7.28107-1.581411，其中7为 电流信号强度，x为呕吐毒素浓度，呕吐毒素的浓度在10pg/mL~1000ng/mL范围内与ip成反 比，线性相关系数为0.9979,得到呕吐毒素含量测定标准曲线如图3所示。以大于噪音信号3 倍的电流信号对应的浓度为最低检出限，重复5次以上实验得出，得到上述方法的最低检出 限为 5pg/mL。
[0031] 4)测定待测样品中的呕吐毒素含量:将5此呕吐毒素抗体(将成品按体积比1:150 稀释)和5yL待测样品溶液(待测样品溶液采用现有常用技术对待测样品提取得到)混合，滴 加在步骤2)处理过后的玻碳电极表面，在37°C烘箱中孵育90分钟。然后用0.01mol/L，pH为 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗，加入10yL碱性磷酸酶标记的二抗（将成品按体积比1: 200稀 释），在37°(：烘箱中孵育90分钟。用0.01111〇1/1，？11为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗后于含 0.75mg/mLa-磷酸萘酯(a-NP)的二乙醇胺(DEA)溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，测定 碱性磷酸酶标记的二抗电化学信号，根据标准曲线即可得到待测样品中的呕吐毒素含量。 [0032]利用上述方法，测定小麦样品中的呕吐毒素:待测小麦粉先加甲醇-水溶解，再加 PBS缓冲液，然后过免疫亲和柱净化提取得到待测样品溶液，将待测样品溶液与呕吐毒素抗 体混合后用上述方法检测。实际样品中呕吐毒素的回收率测定结果见表1，从表中的回收率 可见本检测方法准确可靠。
[0033]表1小麦加标回收率测定
[0035] *数据为3次实测平均。
【主权项】
1. 一种呕吐毒素的电化学检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 在玻碳电极上修饰单壁碳纳米管/壳聚糖复合物：将玻碳电极抛光打磨，超纯水清 洗，接着用丙酮和硝酸混合液清洗，再用超纯水冲洗，晾干，将单壁碳纳米管/壳聚糖分散液 滴涂于电极表面，晾干； 2) 抗原DON-BSA连接到玻碳电极上:将步骤1)晾干的电极用磷酸盐缓冲溶液冲洗，浸泡 于EDC和NHS的混合溶液中，33~40 °C孵育50~70分钟，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗玻碳电 极，立即将牛血清白蛋白-呕吐毒素偶联抗原滴涂于电极表面，33~40°C孵育50~70分钟， 用磷酸盐缓冲溶液冲洗，用牛血清白蛋白溶液孵育封闭剩余的活性位点； 3) 测定待测样品中的呕吐毒素含量:将过量的呕吐毒素抗体和待测样品溶液混合，滴 加在步骤2)处理过后的玻碳电极表面，33~40°C孵育75~100分钟，用磷酸盐缓冲溶液冲 洗，加入碱性磷酸酶标记的二抗，33~40 °C孵育75~100分钟，磷酸盐缓冲溶液冲洗，进行差 分脉冲伏安扫描，测定碱性磷酸酶标记的二抗电化学信号，根据标准曲线即可得到待测样 品中的呕吐毒素含量。2. 根据权利要求1所述的呕吐毒素的电化学检测方法，其特征在于，所述步骤3)中的标 准曲线获得方法为:将过量的呕吐毒素抗体和含不同浓度呕吐毒素的标液分别混合得到不 同混合液，分别将混合液滴加在权利要求1中所述步骤2)处理过后的玻碳电极表面，33~40 °C孵育75~100分钟，磷酸盐缓冲溶液冲洗，加入碱性磷酸酶标记的二抗，33~40 °C孵育75 ~100分钟，磷酸盐缓冲溶液冲洗后于含0.75mg/mLa-磷酸萘酯的二乙醇胺溶液中进行差分 脉冲伏安扫描，测定碱性磷酸酶标记的二抗电化学信号，采用线性回归法得到呕吐毒素含 量测定标准曲线。3. 根据权利要求1所述的呕吐毒素的电化学检测方法，其特征在于，所述步骤1)中玻碳 电极的直径为3mm，所述玻碳电极的抛光打磨用直径为0.05μηι的AI2O3抛光粉打磨。4. 根据权利要求1所述的呕吐毒素的电化学检测方法，其特征在于，所述步骤1)中单壁 碳纳米管/壳聚糖分散液中单壁碳纳米管/壳聚糖复合物的浓度为lmg/mL，使用量2yL。5. 根据权利要求1所述的呕吐毒素的电化学检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶 液的浓度为0 · 0 Imo 1/L，pH为7 · 4 〇6. 根据权利要求1所述的呕吐毒素的电化学检测方法，其特征在于，所述步骤2)中EDC 和NHS的混合溶液使用量为50yL，其中含5mmo 1/L EDC、2mmo 1/LNHS;牛血清白蛋白-呕吐毒 素偶联抗原浓度为I 〇yg/mL，使用量为I OyL。7. 根据权利要求1所述的呕吐毒素的电化学检测方法，其特征在于，所述步骤3)中玻碳 电极在含〇.75mg/mLa-磷酸萘酯的二乙醇胺溶液中进行差分脉冲伏安扫描。8. 根据权利要求1所述的呕吐毒素的电化学检测方法，其特征在于，所述丙酮和硝酸混 合液为丙酮和硝酸按体积比1:1混合得到。
【文档编号】G01N27/327GK105911123SQ201610506059
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】高洁莹, 李朝睿, 卿颖, 邱景富
【申请人】重庆医科大学