专利名称：一种利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种纤维素糖化过程的高效生产方法，特别是一种利用复合纤维素酶系和 化学激活剂糖化纤维素的方法。
背景技术：
随着石油资源的日益枯竭，粮食的日益紧张，以及对乙醇、丁醇等为主的液体燃料和 其他生物质化工产品(乳酸、丁二酸等)的巨大需求，促使以木质纤维素为原料生产可发 酵的糖，然后生物转化生物化工产品的研究与开发成为中国、美国等世界耗能大国的科学 界和产业界的热点。
我国是一个农业大国，每年形成的农业废弃物约有7亿t，其中麦草秸秆l.l亿t,稻 草秸秆1.8亿t，棉秸1300万t,大豆秸秆1500万t,其中麦草秸秆产量约占秸秆总量的约 18%。除少数秸秆被作为牲畜饲料、农家肥和农村燃料外，大多数秸秆被堆放或直接焚烧， 不仅造成生物质资源的巨大浪费，也带来严重的环境污染问题。利用这些农村秸秆发展纤 维素乙醇和生物化工产品，足以解决我国面临的能源危机，同时可以为生物化工发展提供 原料。
但目前的纤维素糖化过程的中试技术存在制约工业化的非常突出的问题。一是生产中
要添加除纤维素酶外的价格昂贵的e-葡萄糖苷酶，以避免纤维二糖抑制。二是在高底物
含量度15% (w/w)以上的条件下，大量的纤维素未被转化，酶解效果显著降低，其转化 率约降为低浓度下(5%w/w)酶解效率的一半，通常只有40-50%。
目前国内专利报道了三个关于纤维素乙醇的工艺，但经济可行性不强。中国专利CN 101130792A公开了酶解秸杆制备燃料乙醇的方法，发酵时间10-15天，酶解效率十分低下， 没有工业化的经济可行性。中国专利CN101270372A公开了一种纤维素乙醇发酵液中糖液 的浓縮方法，目的也是想解决酶解后的糖浓度过低的问题，这表明现在酶解技术不能满足 工业化要求。虽然采用这个浓縮专利技术可以改变已经酶解糖的浓度，但对纤维素的酶解 率低下的问题并没有解决，会导致原料利用率低，生产成本髙的问题。专利CN 101230359 公开了一种利用改性聚二甲基硅氧烷高分子膜提浓的纤维素乙醇工艺，也是想解决发酵酒 精浓度过低，蒸熘成本过高的问题，但也无法回避酶解和发酵效率低的问题。
因此决定木质纤维素的生物加工过程中的经济性的一个重要因素是底物的浓度和酶解效率。
发明内容
本发明是针对以上问题，充分利用复合纤维素酶系的协调酶解机制，在化学激活剂的 作用下，改善高底物浓度下纤维素酶与底物相互作用的微环境，实现纤维素的高糖化率， 降低糖化工艺的纤维素酶的用量，减少工艺成本，提供一种效率高的纤维素糖化工艺，为 纤维素的糖化后的发酵提供高浓度的廉价碳源。
本发明的目的是这样实现的 一种利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方 法，过程如下
(1) 产酶用混合固体料液制备麦麸6-100kg;秸秆或锯末25-350kg;磷酸二氢钾
1. 5-33kg;硫酸铵1. 8-21kg;硫酸镁0. 56-5kg;氯化钴0. 16-1. 5kg; Tween 80 0. 01-0. 3kg 与水50-1000kg混合后得到混合固体料液；
(2) 接种将绿色木霉和黑曲霉混菌种子液分别培养，按照绿色木霉黑曲霉混菌
=1: 1-3的比例接种到混合固体料液中，体积比，l亿个细胞数/ml，控制温度在60-70%，
每隔4小时通风一次；
(3) 复合纤维素酶系提取接种培养5天后从固体料曲中提取复合纤维素酶系，控
制酶系中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和e-葡萄糖苷酶的比例以干物质为基准为6-10:
l-4: l-4;
(4) 葡萄糖和纤维二糖制备在得到的复合纤维素酶系中添加纤维素酶激活剂，以
酶的质量计，纤维素酶激活剂加入量为10-500mg/kg，酶水解的pH值控制在4. 5-5. 0，温
度控制在45-60°C，木质纤维素类生物质的固体含量以质量比计为25-35%,搅拌转速
50-200rPm，酶解时间控制在60-72小时，得到葡萄糖和纤维二糖。
所述木质纤维素类生物质是麦杆、稻杆、速生林以及环境和生物中废弃的富含纤维素 的生物质，生物质含有植物干重的20-70%的纤维素和10-40%的半纤维素，以及部分木质素。
所述的纤维素酶激活剂的组分包括含有金属离子的盐类和表面活性剂。 所述的金属离子是第一副族Cu2+、第二副族Zn2+、第七副族Mt^+和第八副族Fe2+、 Fe3+、 C。2+或Ni2+。
所述的表面活性剂主要是十六垸基三甲基溴化铵CTAB、十二垸基磺酸钠SDS、聚乙 二醇对异辛基苯基醚x-100、聚氧乙烯月桂醚Brij3、吐温20和吐温80以及聚乙二醇PEG 系列。
所述的聚乙二醇PEG为PEG2000, PEG4000和PEG6000。本发明提供的利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法，利用混合纤维素酶 系为催化剂，在优化的搅拌速度下，通过添加纤维素酶激活剂，实现纤维素的高糖化率转 化的技术。利用纤维素酶法水解后的葡萄糖浓度可达到150g/L，是一种具有经济可行性的 纤维素糖化生产技术。使用本工艺，可以实现低成本、低酶用量、高糖化率，满足纤维素
乙醇和生物化工产品(乳酸、丁二酸等)的生产。整个工艺不需要额外添加e -葡萄糖苷 酶，不需要增加糖浓缩装置工艺简单，设备成本低，具有巨大的工业化前景。 具体实施方法 例l
将绿色木霉和黑曲霉种子液分别培养，按照l: 1比例接种到含麦麸6kg，秸秆25kg， 磷酸二氢钾1. 5kg，硫酸铵1. 8kg，硫酸镁0. 56kg，氯化钴0. 06kg， Tween 80 0. Olkg， 水50kg的混合固体料液中。控制湿度在60%，每间隔4小时通风一次，以确保有足够的氧 气。培养5天后从固体提取复合酶系。得到的复合酶系内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和P -葡萄糖苷酶三者比例为7: 2: 2。在l吨的反应釜中，加入含复合酶系的混合液体700kg， 添加化学激活剂氯化铁1. 0g ， 2g Tween80 ， 3. 5g PEG4000 ，控制温度5(TC，搅拌速度 100rpm，酶解64小时，酶水解的pH值控制在4. 5-5. 0，经高效液相测定含葡萄糖135g/L， 纤维二糖llg/L。 例2
将绿色木霉和黑曲霉种子液分别培养，按照l: 2比例接种到含麦麸10kg，秸秆40kg， 磷酸二氢钾3.5kg，硫酸铵2.3kg，硫酸镁0.7kg，氯化钴O. 16kg， Tween 80 0.02kg，水 100kg的混合固体料液中。控制湿度在70%，每间隔4小时通风一次，以确保有足够的氧
气。培养5天后从固体提取复合酶系。得到的复合酶系内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和e
-葡萄糖苷酶三者比例为8: 1: 1。在2吨的反应釜中，加入含复合酶系的混合液体1200kg， 添加化学激活剂氯化锰2.4g ， 1.6g Tween80 , 4.8g PEG6000，控制温度55°C,搅拌速 度110rpm，酶解66小时，酶水解的pH值控制在4. 5-5. 0，经高效液相测定含葡萄糖150g/L， 纤维二糖30g/L。 例3
将绿色木霉和黑曲霉种子液分别培养，按照1:3比例接种到含麦麸100kg，锯末350kg, 磷酸二氢钾33kg,硫酸铵21kg,硫酸镁5kg，氯化钴1. 5kg， Tween80 0. 3kg，水1000kg 的混合固体料液中。控制湿度在70%，每间隔4小时通风一次，以确保有足够的氧气。培 养5天后从固体提取复合酶系。得到的复合酶系内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和e-葡萄
5糖苷酶三者比例为5: 2: 3。在1吨的反应釜中，加入含复合酶系的混合液体650kg，添 加化学激活剂氯化锌1. 2g， 1. 8g Tween80, 2, 3g PEG2000，控制温度5(TC,搅拌速度190rpm, 酶解72小时，酶水解的pH值控制在4.5-5.0，经高效液相测定含葡萄糖145g/L，纤维二 糖23g/L。
权利要求
1、一种利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法，其特征在于(1)产酶用混合固体料液制备麦麸6-100kg；秸秆或锯末25-350kg；磷酸二氢钾1.5-33kg；硫酸铵1.8-21kg；硫酸镁0.56-5kg；氯化钴0.16-1.5kg；Tween 800.01-0.3kg与水50-1000kg混合后得到混合固体料液；(2)接种将绿色木霉和黑曲霉混菌种子液分别培养，按照绿色木霉∶黑曲霉混菌＝1∶1-3的比例接种到混合固体料液中，体积比，1亿个细胞数/ml，控制温度在60-70％，每隔4小时通风一次；(3)复合纤维素酶系提取接种培养5天后从固体料曲中提取复合纤维素酶系，控制酶系中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的比例以干物质为基准为6-10∶1-4∶1-4；(4)葡萄糖和纤维二糖制备在得到的复合纤维素酶系中添加纤维素酶激活剂，以酶的质量计，纤维素酶激活剂加入量为10-500mg/kg，酶水解的pH值控制在4.5-5.0，温度控制在45-60℃，木质纤维素类生物质的固体含量以质量比计为25-35％，搅拌转速50-200rpm，酶解时间控制在60-72小时，得到葡萄糖和纤维二糖。
2、 根据权利要求1所述的利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法，其特 征在于所述木质纤维素类生物质是麦杆、稻杆、速生林以及环境和生物中废弃的富含纤 维素的生物质，生物质含有植物干重的20-70%的纤维素和10-40%的半纤维素，以及部分 木质素。
3、 根据权利要求1所述的利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法，其特 征在于所述的纤维素酶激活剂的组分包括含有金属离子的盐类和表面活性剂。
4、 根据权利要求3所述的利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法，其特 征在于所述的金属离子是第一副族Cu2+、第二副族Zn2+、第七副族Mi产和第八副族Fe2+、 Fe3+、 Cq2+或M2+。
5、 根据权利要求3所述的利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法，其特 征在于所述的表面活性剂主要是十六烷基三甲基溴化铵CTAB、十二烷基磺酸钠SDS、聚 乙二醇对异辛基苯基醚x-100、聚氧乙烯月桂醚Brij3、吐温20和吐温80以及聚乙二醇 PEG系列。
6、 根据权利要求5所述的利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法，其特 征在于所述的聚乙二醇PEG为PEG2000， PEG4000和PEG6000。
全文摘要
一种利用纤维素复合酶系生产葡萄糖和纤维二糖的方法，利用混合纤维素酶系为催化剂，在优化的搅拌速度下，通过添加纤维素酶激活剂，实现纤维素的高糖化率转化的技术。利用纤维素酶法水解后的葡萄糖浓度可达到150g/L，是一种具有经济可行性的纤维素糖化生产技术。使用本工艺，可以实现低成本、低酶用量、高糖化率，满足纤维素乙醇和生物化工产品(乳酸、丁二酸等)的生产。整个工艺不需要额外添加β-葡萄糖苷酶，不需要增加糖浓缩装置工艺简单，设备成本低，工业化前景好。
文档编号C12P19/16GK101603065SQ20091006228
公开日2009年12月16日 申请日期2009年5月26日 优先权日2009年5月26日
发明者俞学峰, 晶 曾, 李志军, 汤金婷, 涛 牛, 龚大春 申请人:三峡大学