一种纤维素酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域和酶工程领域，具体涉及一种纤维素酶，编码该酶的基 因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是指能够水解纤维素 β -1，4-葡萄糖苷键，使得纤维素变成纤维二糖 和葡萄糖的一类酶系的总称，根据对糖苷键不同的催化作用，可以分为外切葡聚糖苷酶 (1，4_ β -D-glucanase 或 exo-1, 4_ β -D-glucanase，EC3. 2. 1. 91，来自真菌的简称 CBH，来 自细菌的简称 Cex)，内切葡聚糖苷酶（1，4_ β -D-glueanase 或 end〇-l，4_ β -D-glueanase， EC 3. 2. I. 4, CMC酶，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Cen)和β -葡聚糖苷酶 (0-l，4-glucosidase，EC3. 2. 1.21，简称BG)。其中内切葡聚糖苷酶作用于纤维素分子内 部的无定型区，能随机水解β-1，4-糖苷键，将长的纤维素分子截短，产生大量不同长度的 带非还原性末端的小分子纤维素。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种纤维素酶，编码该酶的基因， 含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。
[0004] 本发明采用的技术方案如下： 本发明旨在提供一种从芽孢杆菌sp. 48-1中分离得到的纤维素酶基因，该 基因核苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQ ID NO. 2所示，或与SEQ ID NO. 2互补的核苷 酸序列，该基因序列长度为1086 bp (碱基)。
[0005] 本发明的核苷酸序列是DNA形式的，包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，可 以是单链的或是双链的。由于核苷酸序列的特殊性，任何与SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序 列具有80%以上同源性且具有相同功能的多核苷酸变体，均在本发明的保护范围之内。所 述多核苷酸变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列，可以使用本领域所 熟知的取代、缺失或插入变异来获得。
[0006] 本发明中的纤维素酶基因编码的氨基酸序列是具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸残 基序列的多肽或蛋白质。由于氨基酸序列的特殊性，只要是含有SEQ ID NO. 1所示氨基酸 序列的多肽片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物与SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸残基序列具有90%以上同源性且具有相同活性的蛋白质，均在本发明的保护范围之 内。这些方法包括氨基酸序列中氨基酸残基的缺失、插入、化学修饰或替换，所述蛋白可以 是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种含有纤维素酶基因的重组表达载体，是将SEQ ID NO. 2所示基因直接与不同表达载体连接所构建的重组载体。
[0008] 本发明中，编码纤维素酶的多核苷酸序列可以插入到载体中，以构成含有本发明 所述的重组载体。载体是指本领域所熟知的质粒、病毒或其他载体，建议优选PET载体系列 及其他原核表达载体。可用本领域技术人员熟知的方法来构建含编码纤维素酶的核苷酸序 列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技 术、体内重组技术等。所述编码纤维素酶的核苷酸序列可以有效连接到表达载体中的适当 启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的Iac或trp启动 子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和 晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细 胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子 等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA 表达的顺式作用因子，通常大约有10_300bp，作用于启动子以增强基因的转录，如腺病毒增 强子。
[0009] 本发明中，编码纤维素酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可以用本领域 的技术人员熟知的方法转化或者导入到宿主细胞中，该细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、植 物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代，代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞或酵母； 植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9 ;动物细胞如CHO、COS或Bowes黑 色素瘤细胞等。
[0010] 本发明还涉及所述编码基因在制备重组纤维素酶中的应用，通过常规的重组DNA 技术，利用本发明的多核苷酸序列可以构建表达或生产重组的纤维素酶。一般来说可以通 过以下步骤实现：构建重组载体，转化入宿主细胞构建重组细胞，在合适的培养基中培养宿 主细胞，从培养基或细胞中分析、纯化蛋白质。
[0011] 本发明与现有技术相比，其有益效果为： 本发明利用大肠杆菌表达系统构建了纤维素酶的工程菌，可以用来快速、大量表达纤 维素酶。所需培养基及培养条件简单，工艺简单，周期短，可以大大降低生产成本。在构建载 体时在纤维素酶的C-末端加入了组氨酸（His)标签，可与镍柱特异性结合，便于纯化。该 纤维素酶基因来源于烤烟表面微生物基因组，可以利用生产的纤维素酶作用于烤烟纯化过 程，进而改变烤烟纯化进程，有利于改善烟叶品质。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明构建的大肠杆菌BL21 (DE3)表达载体48-pET-30a ; 图2为本发明中重组质粒的双酶切图谱，图中：M是marker ;泳道1是重组质粒，泳道2 是双酶切结果，泳道3是克隆产物。
[0013] 图3是本发明SDS-PAGE检测纯化效果示意图，图中M是marker，泳道1是未加诱 导剂对照；2是未纯化的诱导表达蛋白；3是纯化后的蛋白。
[0014] 图4为本发明中用不同浓度咪唑洗脱蛋白后SDS-PAGE检测结果示意图，图中M是 marker，泳道 1~8 分别为 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 500mmol/l 咪唑洗脱液。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0016] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发 明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未