一种中性植酸酶及其在水产饲料中应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一种中性植酸酶突变体及其在水产 饲料中的应用。 技术背景
[0002] 磷是鱼类所必需的重要矿物元素之一，鱼体对磷的需要量高于其他矿物元素但饲 料中过量的磷被认为是造成水体富营养化的重要因素之一。因此，通过提高鱼类对原料中 磷的利用率，适当调整饲料中磷的含量，使其更接近鱼的需要量，来降低养殖鱼类磷的排放 量，是减少水环境污染的重要途径。
[0003] 植酸酶作为一种由微生物发酵生产的酶制剂，可分解植酸和植酸盐，促进饲料中 植酸和植酸盐的分解，使磷、磷酸根结合的内源性酶和其它营养素得以释放和利用，减少粪 磷对环境的污染，节省无机磷酸盐的添加。多项研宄证明，在水产养殖中植酸酶替代部分磷 酸二氢钙表现出了较好的养殖效果和环境效益。罗琳等（2007)在基本花鲈试验研宄表明 用中性植酸酶部分替代磷酸二氢钙是完全可行的，并得出中性植酸酶l〇〇〇U/kg替代80% 左右的磷酸二氢钙综合生长效果最佳，也证明中性植酸酶存在一定的广谱应用性。近期研 宄还表明中性植酸酶在有胃和无胃水产动物均表现较好性能，可以在水产动物胃肠道中释 放大量的有效磷。
[0004] 但当前市场上的植酸酶以酸性植酸酶为主，在pH 2. 5和5. 5条件下活性最高，而 在无胃水产动物消化道中，由于没有胃酸的分泌，消化道中PH约呈中性，不利于酸性植酸 酶发挥作用。因此目前急需开发一种在中性PH范围内具有较高酶活的植酸酶。
【发明内容】
[0005] 本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型中性植酸酶及其应用。本发明通过 随机突变的方法对植酸酶PHYA进行改造，获得一种突变体蛋白，其pH适用范围更偏向中性 条件，有利于其在水产饲料中的广泛应用。
[0006] 本发明一方面提供了一种植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。
[0007] 所述植酸酶的一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。
[0008] 本发明另一方面提供了一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO :1的植酸 酶的突变获得的，其一种氨基酸序列为SEQ ID NO :3或5,对应的编码核苷酸序列为SEQ ID NO :4、6〇
[0009] 本发明另一方面提供携带有编码序列为SEQ ID NO :3或5的植酸酶突变体基因的 质粒。
[0010] 本发明再一方面提供了一种重组黑曲霉，是将上述质粒转入黑曲霉中构建得到 的。
[0011] 本发明还提供了上述植酸酶突变体在水产饲料中应用。
[0012] 本发明筛选到的植酸酶突变体PHYAT5最适反应pH为6. 5,在pH6. 5-7. 0范围内， 能保持80%以上的酶活，当pH为8. O时，仍能保持35%的酶活，取得了意料不到的技术效 果。与野生型相比，植酸酶突变体PHYAT5在中性范围内的酶活水平得到显著提高，最适反 应温度未发生明显变化。所述植酸酶突变体可广泛应用于水产饲料中，从而有利于减少饲 料中无机磷酸盐的添加，降低养殖成本，同时还能有效减少水产动物粪磷对环境的污染。
【附图说明】
[0013] 图1为植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的pH-相对酶活曲线图；
[0014] 图2为植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的温度-相对酶活曲线图。
【具体实施方式】
[0015] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载 的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体 实施例的限定。
[0016] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0017] 实施例1植酸酶基因的获得
[0018] 根据公共基因数据库中的基因序列，优化了合成基因的密码子并人工合成来源于 黑曲霉（Aspergillus niger)的植酸酶基因 PHYA (序列为SEQ ID NO :2)，其编码的氨基酸 序列为 SEQ ID NO :1。
[0019] PCR引物和反应条件如下：
[0020] 引物 I(F) :GCGCGAATTCATGAGCTTCCGGTCCCTG
[0021] 引物 2 (R) : TAAAGCGGCCGCTTAGGCGAAGCACTCGGC
[0022] 反应条件为：94°C变性5min ;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸I. 5min， 30个循环后，72°C保温10min。琼脂糖电泳结果显示，PHYA基因大小为1395bp。
[0023] 实施例2植酸酶突变体的构建及筛选
[0024] 为了提高植酸酶PHYA的在中性条件下的酶活水平，申请人通过定向进化技术对 该酶进行了大量突变的筛选。
[0025] 以PHYA基因为模板，以实施例1所述引物1、2用GeneMorph II随机突变PCR试 剂盒（Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样 酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置 培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1 mM IPTG的 LB+Amp培养基，37°C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用pH 5. 0的缓冲液重悬，反复 冻融破壁，获得含有植酸酶突变子的大肠杆菌细胞裂解液。
[0026] 分别取出40 μ 1裂解液至两块新的96孔板，其中一块稀释到pH 5. 0的缓冲液中， 另一块稀释到PH 7. 0的缓冲液中，分别加入相同pH值的20 μ 1底物，于37°C反应30min 后，加入40ul终止液混匀以终止反应，室温放置IOmin显色，分光光度计415nm处测定吸光 值。实验结果显示：大部分植酸酶突变体在PH 5. 0条件下的酶活高于在pH 7. 0条件下的 酶活，只有少数突变体在pH 7. O条件下酶活高于在pH 5. O条件下的酶活，还有一些突变体 在pH 5.0和pH7. O条件下的酶活水平比突变前均大幅下降。申请人通过对在pH 7. O条件 下的酶活水平显著高于在pH 5. 0条件下酶活的突变体进行DNA测序，最终获得了能提高植 酸酶PHYA在中性pH范围内酶活水平的突变组合：S87R、G159K、S198D三点突变体和A66P、 N102R、S189R、S190P、T270K 五点突变体。
[0027] 将S87R、G159K、S198D三点突变体命名为PHYAT3,其氨基酸序列为SEQ ID NO :3， 其编码核苷酸序列为SEQ ID NO :4。
[0028] 将A66P、N102R、S189R、S190P、T270K五点突变体命名为PHYAT5,其氨基酸序列为 SEQ ID NO :5,其编码核苷酸序列为SEQ ID NO :6。
[0029] 实施例3重组表达载体的构建
[0030] 利用PCR分别扩增植酸酶突变体PHYAT3和PHYAT5的基因片段，引物两端引入 XbaI位点。引物序列如下：
[0031] 引物 3(F) ：GCTCTAGAATGAGCTTCCGGTCCCTG
[0032] 引物 4(R) ：GCTCTAGATTAGGCGAAGCACTCGGC
[0033] PCR反应条件为：94°C变性5min ;然后94°C变性3〇8,56°0复性3〇8,72°0延伸 I. 5min，30个循环后，72°C保温lOmin。琼脂糖凝胶电泳结果显示，PHYAT3、PHYAT5基因为 大小1395bp的片段。
[0034] 将上述获得的植酸酶突变体PHYAT3和PHYAT5基因片段与表达载体pGAU分别进 行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：
[0037] 37°C水