一种分离禽偏肺病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒的分离接种技术领域，具体涉及一种分离禽偏肺病毒的方法。 技术背景
[0002] 禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，AMPV)，又名火鸡鼻气管炎病毒（Turkey Rhinotracheitis Virus, TRTV)，是副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属成员。AMPV感染禽类 可引起急性上呼吸道感染，能致肉鸡产生严重的呼吸道症状、成年鸡头部肿大，是诱发鸡肿 头综合征（Swollen Head Syndrome，SHS)的主要病毒性病原。该病于1978年首次发现于 南非共和国，随后在世界范围内均有发病报导。我国于1998年在黑龙江某肉鸡场的肿头综 合征的鸡群中分离到这一病毒。AMPV的全基因组包括8个基因，分别是N、P、M、F、M2、SH、 G、L。根据病毒G蛋白的差异和血清学分析，AMPV分为A、B、C、D四个亚型。其中，A型和B 型呈全球性分布，在以色列、巴西、俄罗斯、日本、我国以及多数欧洲国家等地均有报道。该 病的典型临床症状是，肿头综合症，以流涕、打喷嚏、眶下窦肿胀、头部肿胀和产蛋率下降等 为主要临床特征，发病率高达100 %，死亡率为25 %~40 %。该病传染性强，传播迅速，能引 起多种禽类感染发病并造成严重的经济损失。
[0003] 目前，分离AMPV的常用方法是卵黄囊、鸡胚成纤维细胞、Vero细胞或鸡的气管环 接种。实际工作中，因为样品多病原混合感染、样品保存和运输条件、培养方法不适当等原 因，导致难以获得预期的病毒分离物，或者分离病毒失败。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种禽偏肺病毒的分离方法，本发明采用混合细胞培养方法从而达到 提升禽偏肺病毒分离率的目的，因此提高了病毒的分利率。
[0005] 本发明的方法，包括如下的步骤：
[0006] 1)样品处理：将采集的临床禽偏肺病毒病发病样品置已灭菌的小烧杯中，用已灭 菌的剪刀剪碎，加入灭菌PBS (pH值7.0~7. 2)混匀，转移至研磨管中进行震荡研磨；取研 磨好的组织混悬液于-70°C、室温交替冻融两次，然后12000r/min、4°C离心10min，在生物 安全柜中取经处理的每份样品上清液2ml，-70°C冻存备用；
[0007] 2)分离SPF鸡胚气管、肺脏组织：取孵化17~19日龄的SPF鸡胚的气管和肺脏 组织，用pH值7. 2的PBS溶液洗涤3~4遍，备用；
[0008] 3)洗涤：将洗涤后的气管和肺组织分别均匀剪成1~2mm3大小的组织块，再用pH 值7. 2的PBS溶液分别洗涤3遍，弃去洗液，备用；
[0009] 4)消化：取步骤3)预剪碎的气管和肺组织置于灭菌的三角瓶中，再分别加入体积 比为6~10倍的浓度为0. 25%的胰酶-乙二胺四乙酸二钠溶液混匀，将瓶口用灭菌的塞 子盖上，再用灭菌纱布包扎后用线绳包扎紧，在37°C条件下进行消化，其中肺脏组织需消化 20~25min，气管组织消化25~30min ;消化后室温3000r/min离心15min，弃去消化液， 将细胞沉淀用pH值7. 2的PBS溶液重悬、均匀震荡洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后以室温、 3000r/min离心10min ;轻轻洗涤2次，离心后留细胞沉淀备用；
[0010] 5)分装培养：取经过洗涤后的细胞沉淀，在二级生物安全柜中用无菌吸管吸取含 10%新生牛血清的DMEM培养基进行充分吹打，以均匀分散细胞，再用无菌纱布过滤细胞悬 液去掉为充分消化的较大组织块，室温下3000r/min离心10min，再将细胞沉淀悬浮于含 10%新生牛血清的DMEM中，进行细胞计数，根据细胞计数结果，再用含10%新生牛血清的 DMEM将两种细胞的密度稀释到2 X IO6个/ml，再将两种细胞悬液等量混合后接入24孔培养 板中，每孔lml，在37°C、5% CO2培养箱中进行培养、观察，直至铺满单层，培养时间为36~ 48h ；
[0011] 6)接种：将步骤1)中-70°C冻存、已处理好禽偏肺病毒病样品上清进行滤过除菌， 接种入步骤5)培养的混合细胞中，接种结束后置于37°C、5% CO2培养箱中进行吸附；吸附 结束后弃去接种液，再往各接种孔中加入含2%新生牛血清的DMHM维持液，然后将培养板 置于37°C、5% CO2培养箱中进行培养，培养至96h收获全部细胞培养物，此为第一代病毒培 养物；
[0012] 7)传代及鉴定取保存的第一代病毒培养物，经室温、-70°c反复冻融2次，按步骤 6)继续进行连续传代培养；依此方法连续传5代。
[0013] 本发明在常用一个临床发病样本、一次一种敏感细胞分离培养的传统方法基础 上，通过同一培养体系、两种混合细胞的分离、传代方法，成功改进AMPV体外培养条件，明 显提高了 AMPV的分离率，减少了传代次数。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1
[0015] 采用本发明SPF鸡胚气管、肺脏原代混合细胞接种法与传统的SPF鸡胚卵黄囊接 种、鸡胚成纤维细胞、Vero细胞以及气管环组织接种方法，进行禽偏肺病毒分离率比较，同 一份样品经处理后分别采用本发明的方法与传统方法进行病毒分离。
[0016] 样品为2013年采自山东威海某鸡场新鲜禽偏肺病毒感染鸡样品51份（经RT-PCR 检测为阳性）。按本发明进行接种，具体操作方法如下：样品处理方法同"
【发明内容】
"中的 1"样品处理"。细胞准备同"
【发明内容】
"中2、3、4、5。以下各实施例和比较例中的样品处理 均相同，不再赘述。然后分别取_70°C冻存、已处理好禽偏肺病毒病样品上清Iml用0.22 μπι 的针式滤器进行滤过除菌，分别接入24孔细胞培养板各孔中，每份样品接种2孔，每孔接种 量100 μ 1，同时设立未接种空白对照，接种结束后改好盖子，做好标记，将24孔细胞培养板 置于37°C、5% CO2培养箱中进行吸附，时长I. 5h，期间每隔30min温和震荡培养板1次使病 毒能与细胞充分接触、吸附；吸附结束后，在二级生物安全柜中弃去接种液，再往各接种孔 中加入1ml含2%新生牛血清的DMEM维持液，然后将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中进 行培养，每隔12h观察一次是否有细胞病变（CPE)产生，培养至96h收获全部细胞培养物， 经-70°C、室温反复冻融2次，继续进行连续传代培养，连续传5代，在第4代部分样品已能 观察到CPE，取第5代病毒培养物进行AMPV RT-PCR检测。结果见表1。
[0017] 比较例1
[0018] 样品为2013年采自山东威海某鸡场新鲜禽偏肺病毒感染鸡样品51份（同上），分 别进行传统培养方法进行接种、培养及鉴定。具体操作方法如下：
[0019] (1)卵黄囊接种取孵化5~8日龄的SPF鸡胚104枚，在暗室中进行照视，划出 气室及胚体位置，于卵黄囊一侧进行打孔，孔口向上，然后取预处理的发病样品滤过除菌上 清液，按每份样品每胚0. 2ml的接种量进行接种，每份样品接种鸡胚两枚，接种后用融化的 石蜡封孔，然后气室朝上将鸡胚置于卵架上进行继续孵化，弃去24h内死亡的鸡胚，孵化至 第5天时全部取出，于4°C条件下过夜，无菌收取尿囊液，再按上述方法连续传至第5代，进 行AMPV RT-PCR检测，鉴定病毒分离结果。结果见表1。
[0020] (2)鸡胚成纤维细胞制备及接种取9~11日龄发育良好的SPF鸡胚3枚，先用 碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，敲碎气室部位的蛋壳，去掉蛋壳，露出壳膜，无 菌挑开壳膜，用眼科镊子挑出鸡胚放入灭菌的平皿中，去除头、四肢和内脏，放入50ml烧杯 中，用乳汉液洗涤胚体3次，用剪刀剪成小米粒大小的组织块，再用乳汉液洗3次，倒入50ml 三角瓶中，然后加入〇. 25%胰酶溶液，每个胚加入4ml，置37°C水浴锅中消化10~15分钟， 至组织块蓬松为止。消化结束后倒掉胰酶，加入乳汉液洗2次，加入10 %新生牛血清的乳 汉液洗1次去掉胰酶，再加入10%新生牛血清的乳汉液20ml吹打，用含8层纱布的漏斗过 滤，重复3次，收集细胞悬液，进行细胞计数，根据技术结果用10 %血清的乳汉液把细胞稀 释至100万/ml，然后把配制好的细胞悬液分装，接入24孔培养板中，每孔Iml，标记细胞名 称、制备日期，放入37 °C、5 % C02的培养箱内培养。一般24h即可长满单层。
[0021] 待细胞长成单层后，按照实施例1的方法将已处理的51份样品接种、吸附、培养观 察，培养至96h收获全部细胞培养物，经-70°C、室温反复冻融2次，继续进行连续传代培养， 连续传5代，取第5代病毒培养无进行AMPV RT-PCR检测。结果见表1。
[0022] 其中禽偏肺病毒RT-PCR检测方法的具体操作步骤如下：
[0023] 1.引物序列
[0024] AMPVTF : 5，-CCGGGACAAGTATCTCTATGG-3，
[0025] AMPVTR : 5，-CAGTCGCCTGTAATCTTCTAGGG-3，
[0026] 引物合成回来后，用DEPC水稀释成20pmol的工作浓度，分装后-20°C保存备用。
[0027] 2.病毒总RNA提取
[0028] 取-70°C保存备用的各临床发病样品处理上清液250 μ L，加750 μ LTRIzol，振荡 混匀，室温（25°〇左右，下同）孵育511^11;加入250以1^氯仿（4°〇预冷），涡旋振摇混匀15 秒，室温孵育5~15min ;12000r/min、4°C离心15min ;取上清（500 μ L)于一灭菌EP管（无 RNA酶）中，加入等体积异丙醇（-20°C预冷），轻轻混匀，室温孵育IOmin(或-80°C沉淀 30min，或-20°C沉淀4小时或过夜）；12000r/min、4°C离心10min ;弃上清，用ImL 75%的乙 醇（DEPC水配制，-20°C预冷）洗涤2次，12000r/min、4°C离心5min ;弃洗涤液，将离心管倒 置于洁净吸水纸上，在通风橱中进行干燥，然后用30 μ L DEPC水溶解RNA，-70°C保存备用。
[0029] 3. AMPV RT-PCR扩增、电泳检测及结果判定
[0030] 按如下体系及条件进行PRRSV阳性样品的0RF5基因扩增。
[0031] AMPV RT-PCR 检测体系
[0032] 组分 用量 Primescript I step enzyme mix 2 μL 2χ I step buffer 25 pL AMPVTF、AMPVTR ^ 各ΙμL (20pmoLM) RNA模板 5pL -^ # Up to 50 无 RNA/DNA 灭菌 H2O pL
[0033] 反应程序：50 °C /30min、94 °C /5min、32X (94 °C /40s、58 °C /40s、72 °C /50s)、 72°C/10min，最后4°C冷却lOmin，扩增结束。反应结束取5yL PCR产物，用1%琼脂糖凝 胶、100V、45min电泳检查扩增结果，预期扩增产物的大小约为320bp，在阳性对照成立的条 件下，如果待检样品的泳道内出现320bp大小的条带则判为阳性，否则判为阴性。
[0034] (3) Vero细胞接种取复苏液氮中保存的Vero细胞，待铺满单层后，用胰酶-乙二 胺四乙酸二钠溶液进行充分消化、或细胞计数，然后均匀接种到24孔细胞