一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有分化潜能和自我更新能力的早期未分化细胞。根据不同的分化 潜能，可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。鸡原始生殖细胞（Primordial Germ Cells，PGCs)是各级生殖细胞的祖细胞，是能够发育成性细胞（精子和卵母细胞）的前体细 胞。在体外适宜培养条件下，其形态、表面标志和分化潜能均类似于胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs)。作为生殖干细胞，PGCs不仅可用于研宄生殖细胞的发育和分化，而且 又可以作为转基因动物遗传操作的有效载体。由于禽类与哺乳动物有着不同的生殖生理特 征，使得禽类转基因的研宄远远滞后于哺乳动物。鸡PGCs作为干细胞来源，可以进行体外 基因修饰然后移植入受体胚胎获得外源细胞的生殖系转移从而得到转基因鸡。这一方法突 破了转基因家禽技术的瓶颈，掀起了研宄家禽PGCs的热潮。
[0003] 禽类PGCs起源于上胚层，即X期胚盘明区的中央盘。在发育到ΧΠ 期时PGCs从胚 盘上胚层移行到下胚层，在原条期形成过程中随下胚层迀移至生殖新月部位，随着胚胎发 育，胚外中胚层侵入生殖新月区开始形成血岛，PGCs就开始通过血岛进入血管内。当胚胎 血液循环系统开始形成，PGCs随血液循环在18HH期穿过血管壁进入生殖原基部位。并在 此分为两群，分别定居左、右两侧生殖嵴。胚胎发育至28HH期时，部分PGCs从右侧迀移到 左侧性腺中，最终定居在左侧性腺。根据PGCs特定的迀移途径，可以从5-8HH期胚胎生殖 新月区、14-17HH期胚胎血液和28HH期生殖腺中分离得到PGCs。由于难以避免上下胚层 以及卵黄的污染，使得5-8HH期生殖新月区的PGCs的分离纯化非常困难，大多数学者选 择从14-17HH血液和28HH生殖腺中分离PGCs。但研宄表明，14HH鸡胚血液循环系统刚刚 形成，血管细小，血液量不多，PGCs含量较少，加上28HH生殖腺内含量大量其他类型的细 胞，使得生殖腺来源的PGCs纯化工作非常复杂。这些因素大大限制了 PGCs的后续培养、研 宄和应用。另外，Song 等研宄发现（Song Y, Duraisamy S, Ali J，et al. Characteristics of long-term cultures of avian primordial germ cells and gonocytes[J]. Biol R印rod. 2014, 90 (I) : 15.)，生殖新月区来源的PGCs比生殖腺来源的PGCs具有更好的增殖 活力和维持更高水平的多能性。
[0004] PGCs的体外培养过程中，既要保证干细胞具备无限增殖能力，同时要保持未分化 状态，然而在胚胎和机体的发育过程中细胞的增殖和分化一般是同时进行的，所以必须筛 选出适宜的细胞培养体系，实现抑制细胞分化以保证细胞的多能性。维持PGCs体外自我更 新和未分化状态最有效的方法是采用饲养层细胞和细胞因子。饲养层细胞一方面为PGCs 提供细胞外基质成分，另一方面可分泌各种抑制分化和促进增殖的生长因子。常用于PGCs 培养的饲养层细胞有小鼠胚胎成纤维细胞（STO)、鸡胚胎成纤维细胞（CEF)和大鼠肝细胞 (BRL-3A)等。维持PGCs体外自我更新及保持发育多能性的必需生长因子，包括干细胞生 长因子（Stem Cell Factor, SCF)、白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Facto, LIF)、 喊性成纤维生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)和膜岛素样生长因 子-I (insulin like growth factor, IGF-1)等因子。除此之外，PGCs培养体系中还需要 添加谷氨酰胺、非必需氨基酸、核苷和β _疏基乙醇等。
[0005] 不同实验室采用不同的PGCs分离方法和培养体系，由于PGCs体外自我更新和多 能性维持的机制尚不明确，而且鸡胚胚盘的分离操作复杂，重复性差，限制了 PGCs进一步 研宄。因而，目前有关鸡PGCs分呙技术和培养体系仍有待改进。
【发明内容】
[0006] 本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种鸡生殖新月来源PGC的分离培养方 法，操作简单，重复性好，具有更好的增殖活力和维持更高水平的多能性。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法，包括以下步骤：
[0009] (1)分离方法是通过贴滤膜法从种蛋中取出无卵黄污染的干净鸡胚，然后在解剖 镜下从鸡胚中获取生殖新月组织；
[0010] (2)用胰酶将生殖新月组织消化成单细胞，然后对单细胞中的PGCs进行纯化；
[0011] (3)将纯化后PGCs置入含有BRL-3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体系中 培养。
[0012] 进一步，步骤（1)包括以下步骤：
[0013] a)新鲜种蛋孵化到5-8ΗΗ期，无菌条件下小心打开蛋壳，将鸡蛋置于无菌培养皿 中，分开蛋清和蛋黄，用眼科剪剪破胚盘上部的浓蛋清，将蛋清刮除干净，露出干燥的卵黄 膜；
[0014] b)取一片直径25mm的微孔滤膜贴于胚盘上部的卵黄膜，按压，使滤膜和卵黄膜紧 紧粘附在一起，用镊子夹住滤膜的边缘，用眼科剪小心的沿着滤膜剪开卵黄膜，剪取胚盘， 提起滤膜离开卵黄；
[0015] c)将附着在滤膜上的胚胎垂直的浸入PBS中，将胚胎放于腹侧面，旋转滤纸，可除 掉绝大部分附着在胚盘上的蛋黄；一般需要准备3~5个装有PBS的培养皿，尽可能的除尽 蛋黄，胚盘在使用PBS洗涤的时候，整个的胚盘会从滤膜上脱落下来，和卵黄膜分开；
[0016] d)将分离的胚盘置于解剖镜下，找到生殖新月区域，用镊子剥离生殖新月组织，将 周围的其他组织切除，得到的生殖新月组织收集在无菌的Ep管中。
[0017] 根据权利要求1所述一种鸡生殖新月来源PGC的分离培养方法，其特征在于，步骤 (2)包括：
[0018] 使用胰酶消化生殖新月组织，离心接种，向含有生殖新月的Ep管中加入37°C预热 的0. 25 %胰蛋白酶，37°C消化5min，以含有5 %的FBS的DMEM终止消化，1000 rpm离心5min， 弃上清，用培养液重新悬浮细胞，然后对PGCs进行纯化。
[0019] 进一步，所述BRL-3A细胞饲养层的制备包括以下步骤：
[0020] a)将冻存的BRL-3A细胞在已预热至37°C的水浴锅中迅速解冻，逐滴加入培养基 稀释至4倍左右；
[0021] b) 1000 rpm离心5min，弃上清，用含10%血清的配制的培养基重悬细胞，转移至细 胞培养皿中，37°C，5% CO2，饱和湿度下培养；
[0022] c)选择生长状况良好、80% -90%汇合的细胞，去掉培养基，用PBS洗涤后加入含 10 μ g/mL丝裂霉素-C的细胞培养基，37°C孵育2h ;
[0023] d)去掉培养基，用PBS洗涤BRL-3A细胞4-6次，以确保完全去除丝裂霉素 -C ;
[0024] e)用胰酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度为5X IO5个/mL，接种于培养板 中，置37°C，5% CO2，培养箱中培养，24h后可使用；
[0025] f)密切观察细胞生长情况，若发现细胞过稀则补加丝裂霉素 -C处理过的细胞，以 保证细胞铺成单层，能连成一片而没有间隙；
[0026] g)将制备好的饲养层放置在培养箱中备用，使用前去除培养液且用PBS洗5次，换 为干细胞培养液；一般制备好的饲养层在5天内使用。
[0027] 进一步，所述PGC完全培养液的配方如下：总和100mL，
[0028] KO-DMEM 83 mL； FBS 7.5 mL； CS: 2.5 mL； 2 mM GIutaMAX-I： I mL； 100 XNAA I mL; 100 X nucleosides I mL； IOOX f3 -ME I mL; I μ g/mL LIF 0.5 mL； I μ g/mL SCF 0.5 mL； I μ g/mL bFGF I mL； Penicillin-Streptomycin； I mL〇
[0029] 进一步，步骤（3)生殖新月来源PGCs的体外培养：
[0030] (1)将重悬的生殖新月细胞接种于铺有BRL-3A细胞饲养层的6孔板上，并以PGCs 完全培养液，置于37. 5°C、含5% CO2的培养箱中进行原代培养；
[0031] (2)原代培养3天后，收集培养液，其含有悬浮的PGCs，1000 rpm离心5m