心的沿着滤膜快速的剪开卵黄 膜，剪取胚盘，轻轻提起滤膜离开卵黄。
[0092] ⑶慢慢地将附着在滤膜上的胚胎垂直的浸入PBS中，动作要轻缓，否则胚盘容易 和滤纸分开，这是从胚胎上去除卵黄的一个重要步骤。将胚胎放于腹侧面，旋转滤纸，可很 好的除掉绝大部分附着在胚盘上的蛋黄；一般需要准备3~5个装有PBS的培养皿，尽可 能的除尽蛋黄。胚盘在使用PBS洗涤的时候，整个的胚盘会从滤膜上脱落下来，和卵黄膜分 开。
[0093] (4)将分离的胚盘置于解剖镜下，找到生殖新月区域，用镊子轻轻剥离生殖新月组 织，将周围的其他组织切除。得到的生殖新月组织收集在一个无菌的Ep管中。
[0094] 2、生殖新月来源PGCs的制备
[0095] 使用胰酶消化生殖新月组织，离心接种。向含有生殖新月的Ep管中加入37°C预 热的0. 25%胰蛋白酶，37°C消化5min。以含有5%的FBS的DMEM终止消化。1000 rpm离心 5min，弃上清，用培养液重新悬浮细胞，然后对PGCs进行纯化。
[0096] 二、PGCs 的培养
[0097] 1、BRL-3A细胞饲养层的制备
[0098] (1)将冻存的BRL-3A细胞在已预热至37°C的水浴锅中迅速解冻，逐滴加入培养基 稀释至4倍左右；
[0099] (2) 1000 rpm离心5min，弃上清。用含10%血清的新鲜配制的培养基重悬细胞，转 移至细胞培养皿中，37°C，5% C02,饱和湿度下培养；
[0100] (3)选择生长状况良好、80% -90%汇合的细胞，去掉培养基，用PBS洗涤后加入含 10 μ g/mL丝裂霉素-C的细胞培养基，37°C孵育2h ;
[0101] (4)去掉培养基，用PBS洗涤BRL-3A细胞4-6次，以确保完全去除丝裂霉素 -C ;
[0102] (5)用胰酶消化，制备单细胞悬液。调整细胞密度为5 X 105个/mL，接种于培养板 中，置37°C，5% C02,培养箱中培养，24h后可使用；
[0103] (6)密切观察细胞生长情况，若发现细胞过稀则补加丝裂霉素-C处理过的细胞， 以保证细胞铺成单层，能连成一片而没有间隙；
[0104] (7)将制备好的饲养层放置在培养箱中备用，使用前去除培养液且用PBS洗5次， 换为干细胞培养液；一般制备好的饲养层在5d内使用。
[0105] 2、PGCs完全培养液的配制，PGC完全培养液的配方如下（此配方为优化后的配 方）：
[0106]
[0107] 注：FBS:胎牛血清；CS:鸡血清；GlutaMAX-I:谷氨酰胺；NAA:非必需氨基酸； nucleosides:核苷；β-ME : β -巯基乙醇；LIF:白血病抑制因子；SCF:干细胞生长因子； bFGF:碱性成纤维生长因子；Penicillin-Streptomycin:双抗。
[0108] 3、生殖新月来源PGCs的体外培养
[0109] (1)将重悬的生殖新月细胞接种于铺有BRL-3A细胞饲养层的6孔板上，并以PGCs 完全培养液，置于37. 5°C、含5% C02的培养箱中进行原代培养；
[0110] (2)原代培养3天后，收集培养液（含有悬浮的PGCs)，1000 rpm离心5min，弃上清， 用完全培养液重新悬浮细胞。调整细胞密度，重新溶于新培养液置于新饲养层上进行传代 培养；
[0111] (3)待PGCs原代培养5-7d后会形成PGCs克隆，克隆形成即可进行细胞传代。
[0112] 三、PGCs的鉴定
[0113] I、PGCs 的 RT-PCR 鉴定
[0114] (I)PGCs特异性基因引物的合成。根据GenBank中的基因序列，用Primer5.0软件 设计引物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0115] NANOG:
[0116] F:5'-TGGTTTCAGAACCAACGAATGAAG-3'
[0117] R:5'-TGCACTGGTCACAGCCTGAAG-3'
[0118] POUV:
[0119] F:5'-GTTGTCCGGGTCTGGTTCT-3'
[0120] R:5'-GTGGAAAGGTGGCATGTAGAC-3'
[0121] SOX 2:
[0122] F:5'-GAAGATGCACAACTCGGAGATCAG-3'
[0123] R:5'-GAGCCGTTTGGCTTCGTCA-3'
[0124] DAZL:
[0125] F:5'-CGTCAACAACCTGCCAAGGA-3'
[0126] R:5'-TTCTTTGCTCCCCAGGAACC-3'
[0127] CVH:
[0128] F:5'-GTCTGCCTGTGCAGCATGACATTG-3'
[0129] R:5'-CTTTGCCCAAAGATGCCAGGAACTC-3'
[0130] β -ACTIN:
[0131] F:5'-ATTGTCCACCGCAAATGCTTC-3'
[0132] R:5'-AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC-3'
[0133] (2)参照RNA抽提试剂盒从PGCs中抽提总RNA。取第2代的PGCs，放入I. 5mL EP管中，加入750 μ L预冷的RNAiso Plus ;将样品吹打剧烈混匀后，室温静置5min ;加 入250 μ L氯仿，剧烈振荡使液体充分混匀呈乳白状，在室温静置5min ;在4°C条件下， 12000rpm离心15min ;将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠 倒混勾，然后在4°C静置15min ;在4°C条件下，12000rpm离心15min，小心并尽可能去掉全 部上清；用75 %乙醇洗涤RNA沉淀和管壁，在4°C条件下，12000rpm离心10min，然后小心弃 去乙醇；将RNA沉淀进行干燥处理后，用20 μ L RNase-free水溶解RNA，-20°C短期保存，或 直接用于反转录。
[0134] (3)参照TaKaRa公司的AMV逆转录酶使用说明进行反转录。反应体系为：总RNA 1 μ L，dNTPs 6 μ L，5 X AMV Buffer 4 μ L，随机引物 1 μ L，RNA 酶抑制剂 1 μ L，AMV 1 μ L，加 ddH20至总体积为20 μ L ;42°C反转录Ih后，获得cDNA。
[0135] (4)以获得的cDNA为模板，应用上述⑴引物进行PCR扩增，反应体系（25 μ L): 10\811打6『2.5 41^，(1阶138(21111)2 41^，，引物？141^，引物1?141^，。0嫩141^，丁&9酶141^， 加 CldH2O 至 25 μ L。反应条件为：94°C预变性 5min ; (94°C 30s，51-59°C 30s，72°C 45s) X 30 个循环；72°C，8min，4°C保存。PCR结束后，取扩增产物5yL在质量体积比1%的琼脂糖凝 胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。
[0136] 2、PGCs的间接免疫荧光检测
[0137] 取第3代的PGCs进行SSEA-I和DAZL的免疫荧光染色鉴定。取生长良好的PGCs， 去除培养基，用PBS清洗3次后；加入固定液（4%的多聚甲醛）固定30min，PBS漂洗3次； 加入透化剂（0. 2%Triton X100)，冰上孵育20min，PBS清洗3次后；加入封闭液（含有10% FBS的PBS)封闭30min ;PBS漂洗后，加入一抗（SSEA-1、DAZL)4°C孵化过夜；PBS漂洗后，加 入二抗（FIHC-IgG)室温避光孵化Ih ;PBS漂洗，加入DAPI复染后，加入抗荧光淬灭剂，相差 显微镜下观察并拍照。
[0138] 经鉴定，通过本发明方法获得的细胞为阳性原始生殖细胞，且该细胞具有较好的 体外增殖能力。
[0139] 最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述 各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。
【主权项】
1. 一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 分离方法是通过贴滤膜法从种蛋中取出无卵黄污染的干净鸡胚，然后在解剖镜下 从鸡胚中获取生殖新月组织； (2) 用胰酶将生殖新月组织消化成单细胞，然后对单细胞中的PGCs进行纯化； (3) 将纯化后PG