一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方 法与应用。
【背景技术】
[0002] 莽草酸（3, 4, 5-trihydroxy-1-cyclohexene-1-ca;rboxylic acid, shikimic acid，SA)呈白色晶体状，比旋光度[α ] = -157° XcmVgXdnT1，最大紫外吸收在235nm， 其具有多种同分异构体，但只有α型的同分异构体具有生物学活性。莽草酸除可用于合成 苯丙氨酸、络氨酸、色氨酸外，还可用于合成维生素、己二酸等化合物。莽草酸可以通过化学 合成、微生物发酵、植物萃取等手段获得。传统的莽草酸生产主要通过植物萃取进行，植物 八角茴香的果实是工业上获得莽草酸的主要来源。但由于八角茴香仅分布在全球极少数地 区，其产量受气候、自然环境等因素的影响，因此严重限制了莽草酸的产量。化学合成莽草 酸由于产率不高、工艺复杂、价格高昂因而未能广泛开展。利用微生物发酵生产莽草酸具有 操作简单、能耗小、生产成本及低无污染等优点，在当今资源需求量较大、能源紧张、环保要 求不断提高的情况下，展现了特有的优越性和广阔的发展空间。
[0003] 现有的产莽草酸的菌株主要是通过对莽草酸途径基因改造的方式过表达途径中 的aroG、aroB、aroD、aroE四个基因，虽然经过以上方法改造的菌株可以在一定条件下提升 莽草酸的生产效率，但对莽草酸途径的改造策略只强调了过表达途径中的基因，而在翻译 水平使用相同的RBS元件来控制基因的表达，限制了对莽草酸表达能力的进一步提高。例 如：Chen等人对大肠杆菌进行改造，其菌株的莽草酸产量仅为1.85g/L (Chen K，Dou J，Tang S, Yang Y, Wang Η, Fang Η, Zhou C(2012)Deletion of the aroK gene is essential for high shikimic acid accumulation through the shikimate pathway in E.coli. Bioresour Technol 119:141-7)。Cui等人对大肠杆菌进行改造，其菌株的莽草酸产量也 仅为 3. 12g/L(Cui YYjLing CjZhang YYjHuang JjLiu JZ(2014)Production of shikimic acid from Escherichia coli through chemically inducible chromosomal evolution and cofactor metabolic engineering. Microb Cell Fact 13:21)〇
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，通过选 择适当的RBS序列调整莽草酸表达途径中aroG、aroB、aroD、aroE基因的表达量，从而大大 提高莽草酸的产量。
[0005] 本发明提供一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还 包含调控aroG基因表达的RBS1、调控aroB基因表达的RBS2、调控aroD基因表达的RBS3 和调控aroE基因表达的RBS4 ;aroG的基因序列为SEQ ID N0:6所示，aroB的基因序列为 SEQ ID NO: 7所示，aroD的基因序列为SEQ ID NO:8所示，aroE的基因序列为SEQ ID NO:9 所示；
[0006] 在上述技术方案中，RBS1的基因序列为SEQ ID NO :1所示，RBS2的基因序列为SEQ ID NO: 2所示，RBS3的基因序列为SEQ ID NO: 3所示，RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所 不O
[0007] 在上述技术方案中，aroB基因与aroD基因之间还插入有终止子2,终止子2的基 因序列为SEQ ID NO: 11所示。
[0008] 在上述技术方案中，还包含RiboJ基因，RiboJ的基因序列为SEQ ID NO: 5所示。
[0009] 在上述技术方案中，aroG基因与aroG基因的启动子之间插入有RiboJ基因，所述 ar〇B基因与aroB基因的启动子之间插入有RiboJ基因、所述aroD基因与aroD基因的启动 子之间插入有RiboJ基因，所述aroE基因与aroE基因的启动子之间插入有RiboJ基因。 [0010] 本发明还提供了一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：
[0011] 1)将 aroG、aroB、aroD 和 aroE 基因分别插入载体 pXMJ19,得到载体 pXMJ19_aroG、 pXMJ19-aroB、pXMJ19-aroD、pXMJ19_aroE ;
[0012] 2)将aroG中的HindIII和PstI酶切位点，aroB中的BamHI和SpeI酶切位点，aroD 中的PstI酶切位点，aroE中的EcoRI和Sail酶切位点进行突变，得到载体pXMJ19-aroGm、 pXMJ19-aroB?、pXMJ19-aroDm、pXMJ19-aroE?;
[0013] 3)将RiboJ基因插入载体pXMJ19,得到载体pXMJ19-RiboJ ;
[0014] 4)将荧光蛋白基因插入载体pXMJ19_Rib〇J，得到载体pZB ;
[0015] 5)用引物MU-RBSAG-F和MU-RBSAG-R以pXMJ19-aroG?为模板扩增基因片段 aroG?，用引物 MU-RBSAB-F 和 MU-RBSAB-R 以 pXMJ19-aroBm为模板扩增基因片段 aroB m， 用引物MU-RBSAD-F和MU-RBSAD-R以pXMJ19-aroD?为模板扩增基因片段aroD ?，用引物 MU-RBSAE-F 和 MU-RBSAE-R 以 pXMJ19-aroEm为模板扩增基因片段 aroE
[0016] 6)将步骤5)中扩增的基因片段&1'〇6' &1^'&1'〇0?和&1^"11分别插入载体？28， 得到载体 pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD 和 pZB-aroE ;
[0017] 7)步骤6)得到的载体分别转化大肠杆菌，对得到的克隆进行测序，将测序无 误的载体 pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD 和 pZB-aroE 共同转化至 Corynebacterium glutamicumAaroK中，培养并检测焚光强度；
[0018] 8)用引物 aroG-H-F、aroG-H-R 以 pXMJ19-aroG?为模板扩增基因片段 aroG-Η 并 插入载体pXMJ19-RiboJ，得到载体ρΧΜΙΙΘ-Κ?^οΙ-ΒΓοΟ^-Η ;所述aroG-Η的基因序列如SEQ ID NO: 13 所示；
[0019] 9)用引物 aroB-M-F、aroB-M-R 以 pXMJ19-aroB?为模板扩增基因片段 aroB-Μ ;用 aroD-M-F、aroD-M-R 以 pXMJ19-aroD?为模板扩增基因片段 aroD-Μ ;用 aroE-M-F、aroE-M-R 以pXMJ19-aroE?为模板扩增基因片段aroE-Μ ;将扩增的基因片段aroB-M、aroD-Μ和 aroE-Μ 插入载体 pXMJ19-RiboJ，获得载体 pXMJig-RiboJ-aroB^-MjXMJig-RiboJ-aroD^-M 和 pXMJ19-RiboJ-aroEm-M ;所述 aroB-M、aroD-M 和 aroE-Μ 的基因序列依次分别如 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 所示；
[0020] 10)用引物 PB-F、PB-R 以 pXMJig-RiboJ-aroB^-M 为模板扩增基因片 段 Ptac-aroB-M ;用引物 PD-F、PD-R 以 pXMJ19-RiboJ-aroD?-M 为模板扩增基因片 段Ptac-aroD-M ;用引物PE-F、PE-R以pXMJig-RiboJ-aroE^-M为模板扩增基因片段 Ptac-aroE-M，将基因片段 Ptac-aroB-M 插入载体 ρΧ?νυ?θ-Κ?^οΙ-ΒΓοΟ?1-!!，得到载体 PXMJ19-GHBM ;所述 Ptac-aroB-M 的基因序列如 SEQ ID NO: 17 所示；
[0021] 11)将片段 Ptac-aroD-M 插入载体 pXMJ19-GHBM，得到载体 pXMJ19-GHBMDM ;所述 Ptac-aroD-M的基因序列如SEQ ID NO: 18所示。
[0022] 12)将片段 Ptac-aroE-M 插入载体载体 pXMJ19-GHBMDM，得到载体 pXMJ19-GBDE ; 所述Ptac-aroE-M的基因序列如SEQ ID NO: 19所示；
[0023] 13)用引物 Terminator2_F、Terminator2_R 以 pXMJ19 为模板扩增终止子 2,将终 止子2和载体pXMJ19-GBDE分别用XmaI进行酶切，回收终止子2片段和载体，将终止子2 片段和载体进行连接，得到载体PXMJ19-GBTDE ;
[0024] 14)将 pXMJ19-GBTDE 转化至 C. glutamicum RES167 Δ aroK，获得产莽草酸的谷氨 酸棒杆菌。
[0025] 在上述产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法中，步骤4)中的荧光蛋白基因为 egfp基因。
[0026] 本发明还提供了一种生产莽草酸的方法，包括如下步骤：
[0027] 按2%~4%体积比的接种量接种上述任一产莽草酸的谷氨酸棒杆菌种子液到灭 菌后冷至发酵温度的发酵培养基中，所述种子液的OD值为14,温度为30°C，通气速率为 3vvm，发酵过程中补加蔗糖，搅拌转速为300rpm的条件下培养发酵3~5天，获得含莽草酸 浓度