一株γ-聚谷氨酸产生菌及其发酵产物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株γ-聚谷氨酸产生菌，属于微生物和发酵【技术领域】，所述γ-聚谷氨酸产生菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus?licheniformis），保藏号为CGMCC?NO.9169。γ-聚谷氨酸产生菌Dou-6，菌株发酵液直接用做土壤保水剂，且表现较好的保水效果，通过直接稀释菌株Bacillus?licheniformis?Dou-6的发酵液对土壤的保水效果，表明2倍和5倍稀释液均显著起到保水效果，二者达到差异显著水平,在播种、拌种、移苗时经过γ-PGA保水剂拌种、蘸根处理，就能大大提升其成活率，有广阔的应用前景。
【专利说明】一株Y-聚谷氨酸产生菌及其发酵产物的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物和发酵【技术领域】，具体涉及一种Y-聚谷氨酸产生菌及其发酵产物在土壤保水中的应用。
【背景技术】
[0002]农业生产中常存在土壤因保水性差而引起作物缺水，造成减产甚至绝收，因此农业保水对农业生产尤其重要。目前有一些聚丙烯酸系列吸水树脂材料应用于农业保水，但存在成本高、降解慢、对环境不友好等问题。因此具有无残留、不污染环境、绿色环保性能的新型保水剂成为当前研究的热点。由于Y-聚谷氨酸具有水溶性好、保湿性佳、可生物降解等特性，因此在农业上极具应用潜力。
[0003]Y-聚谷氨酸(Y-polyglutamic acid,简称Y-PGA)是一种可由多种微生物发酵产生的氨基酸聚合物。目前研究较多的￥-?64产生菌有及^277心5^07/>5正03335、Bacillus Subtilis TAM-4^BaciIlus Licheniformis WBL-3 及Bacillus SP.B53 等。在发酵产物保水性方面有研究表明Y -PGA的最大自然吸水倍数可达到1108.4倍，高于聚丙烯酸盐类吸水树脂I倍以上，张新民等制备Y -PGA高吸水树脂最高吸水率可达1600 g/g。前人研究多侧重于Y-PGA产生菌的选育鉴定、培养条件或发酵产物的鉴定及其保水性中的单一方面，而围绕一株Y -PGA产生菌的选育鉴定并开展培养条件及其发酵产物在土壤保水性等方面的综合性研究报道甚少。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株Y-PGA产生菌及其发酵产物在土壤保水中的应用，具有较好的保水效果。
[0005]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种Y -聚谷氨酸产生菌Dou-6，分类命名:地衣芽孢杆菌，拉丁文学名-.Bacillus licheniformis，樣蘇H:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称:CGMCC，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2014年05月16日，保藏号为CGMCC N0.9169。
[0006]所述的Y-聚谷氨酸产生菌的发酵产物在土壤保水中的应用。
[0007]本发明的有益效果:本发明的Y-聚谷氨酸产生菌的出发菌株licheniformis Dou-6所用发酵底物中谷氨酸钠添加量仅为30g/L,在没有进一步发酵培养基及发酵条件优化的条件下，底物中谷氨酸转化率达到60%以上，本发明获得的Y-PGA合成菌株合成效率较高，且该菌株的产量随着传代产量递增加了 98.7%，还有进一步增加的可能，有研究通过射线诱变合成菌株后经一定程度的培养基优化，其产能提升了 70%以上，因此通过菌株改造或发酵条件优化预期将获得更高的产量；菌株发酵液直接用做土壤保水剂，且表现较好的保水效果，通过直接稀释菌株licheniformis Dou~6的发酵液对土壤的保水效果，表明2倍和5倍稀释液均显著起到保水效果，二者达到差异显著水平，在播种、拌种、移苗时经过Y-PGA保水剂拌种、蘸根处理，就能大大提升其成活率，有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为菌株D3、D4和D6发酵水解物10倍稀释液纸层析(2、4、6、8、10、20分别指
2、4、6、8、10、20mg/L 谷氨酸标准品)。
[0009]图2为标准谷氨酸色谱图。
[0010]图3为Dou-6发酵产物液相色谱图。 [0011]图4为Dou-6菌株形态图。
[0012]图5为Dou-6菌株染色镜检图。
[0013]图6为不同培养基中菌株Dou-6的生长曲线。
[0014]图7为传代培养对Dou-6菌株聚谷氨酸合成产量的影响。
[0015]图8为Dou-6菌株基于16S rDNA序列的系统发育树。
[0016]图9为Dou-6菌株的发酵产物不同处理的土壤保水效果。
【具体实施方式】
[0017]一种Y -聚谷氨酸产生菌Dou-6，分类命名:地衣芽孢杆菌，拉丁文学名'Bacillus
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位简称:CGMCC，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2014年05月16日，保藏号为CGMCC N0.9169。
[0018]Y-聚谷氨酸产生菌的选育方法，步骤如下:
(1)将2g取自河南省通许县玉皇庙乡申店村的豆酱样品研碎悬浮在无菌蒸馏水中震荡均匀，煮沸15 min，冷却后梯度稀释，并涂布于筛选培养基中，37°C下培养24 h，得到菌落，筛选培养基为LB固体培养基(貧/L)的组成为:葡萄糖10，蛋白胨10，NaCl 5.0，琼脂20，pH=7.0 ；
(2)挑选形态各异、生长旺盛、表面光滑且粘稠的菌落8株，相同的培养条件下，将这几株菌进行反复划线培养三次以上，以获得纯菌株；
(3)将纯化后的菌株接种到含50ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在恒温摇床上培养60 h，恒温摇床的温度为37°C，转速200 r/min，发酵培养基(g/L)的组成为:柠檬酸12，甘油 80，NH4Cl 7.0，谷氨酸钠 30，K2HPO4o 3H20 0.5，FeCl3.6H20 0.05，CaCl2.2H20 0.15，MgSO4.7H20 0.5，MnSO4.H2O 0.1，pH=7.0 ；
(4)选择粘稠度较高的第2、第6和第7号菌的发酵液于8000r/min离心10 min,上清液用4倍乙醇沉淀过夜,再于8000 r/min离心10 min将沉淀物溶于去离子水中，并透析过夜，将透析液冻干称重，得到Y -PGA的含量，量取纯化好的Y -PGA溶液10 mL,放入水解管，加入10mL6mol/L的HC1，抽真空封口，120°C水解24 h，获得Y-PGA水解产物；
(5)用谷氨酸标准品做对照，通过纸层析法检测水解产物中的氨基酸迁移特征，根据各菌株发酵液粘稠度及纸层析结果如图1所示，从图谱上可以看出谷氨酸标准品2、4、8、10、20mg/L与其它三种菌株发酵产物的稀释液基本上处于同一位置，且均只有一个斑点，初步认为3株菌株发酵水解产物是谷氨酸，其中，以菌株Dou-6斑点最亮，结合其发酵液粘稠度，初步判断其Y-PGA合成能力最强，选择第6号菌作为出发菌株，命名为Dou-6。将Dou-6发酵水解进行液相色谱分析测定，从图2和图3得知，发酵产物的峰和谷氨酸标准品的峰图保留时间一致，判定其产物为聚谷氨酸。
[0019]1.菌株Dou-6的形态学特征
挑取Dou-6菌株于筛选培养基划线培养,培养24h后观察菌落形态并照相。另外挑取该菌菌于灭菌去离子水中，震荡后吸取菌液于载玻片上，进行革兰氏染色，用显微镜(NikonEclipse 80i,日本)观察并拍照。结果:固体培养基上该菌生长旺盛，菌落黏稠，用接种环挑取能拉出细丝，菌落表面光滑且蔓延，为乳白色或半透明状。大多数菌落粗糙有皱褶，边缘不规则(图4)。菌株革兰氏染色呈阳性，在电镜下可以看到该菌株呈杆状分布(图5)。
[0020]2.菌株Dou-6的生理生化特征
(I)好氧性试验
把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的所述菌，穿刺接种到上述培养基中(必须穿刺到管底)。30°C培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。
[0021]试验结果表现，菌落沿琼脂柱表面生长，穿刺线内也有菌落生长，为兼性厌氧。
[0022](2)过氧化氢酶的测定 在干净载玻片上滴I滴3%H202，取18~24 h的LB斜面培养物I环，在H2O2中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。试验结果为接触酶阳性。
[0023](3)甲基红试验(M.R试验)
a.培养基及试剂:蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水lOOOmL，调节ρΗ7.0-7.2，分装试管，每管装4~5 mL，12rC灭菌20 min。试剂:甲基红0.lg，95%酒精300 mL，蒸馏水200mL ο
[0024]b.菌种培养及结果观察接种菌株于上述培养液中，30°C培养广2天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性(甲基红变色范围4.4红色~6.0黄色)。
[0025]试验结果为M.R阳性。
[0026](4)乙酞甲基甲醇试验(VP试验)
a.培养基培养基同甲基红试验。b.菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做VP试验时，取培养液(约2mL)和等量的40 %NaOH相混合，加少量肌酸，充分振荡2飞min后，如培养液出现红色，即为VP阳性。
[0027]试验结果为VP阴性。
[0028](5)淀粉水解试验
a.培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121°C灭菌20min备用。路哥氏碘液:碘片lg，碘化钾2g，先用少量(3飞mL)蒸馏水溶解碘化钾，现加入鹏片，待鹏完全溶解后，加水稀释至300mL。
[0029]b.菌种培养及结果观察取菌种点接于平板上，30°C培养2~4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。
[0030]试验结果为淀粉水解阳性。[0031](6)明胶水解试验
a.培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水lOOOmL。调节pH7.2^7.4，分装试管，培养基高度约为4~5cm，121°C灭菌20min。
[0032]b.菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。在30°C温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。
[0033]试验结果为明胶水解阳性。
[0034](7)硝酸盐还原试验
a.培养基及试剂蛋白胨10g，KNO3Ig,蒸馏水1000mL，pH7.0~7.4。格里斯氏(Gries)试剂:A液:对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mL ；B液:蔡胺0.1g,蒸馏水20mL，稀醋酸(10%左右)150mL。二苯胺试剂:二苯胺0.5g溶于IOOmL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。
[0035]b.菌种培养及结果观察将试验菌接种于硝酸盐液体培养基中，30°C培养1、3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴I滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。
[0036]试验结果为硝酸盐还原阳性。
[0037](8)柠檬酸盐的利用
a.培养基及试剂柠檬酸钠 2g，NaCl 5g，MgSO4.7H20 0.2g，(NH4)2.HPO4 lg, 1% 澳百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH6.8-7.0,121°C灭菌20min。
[0038]b.菌种培养及结果观察取幼龄菌种接种于斜面上，30°C培养3-7天，培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应，不变者则为阴性。
[0039]柠檬酸盐利用的试验结果为阳性。
[0040]3.菌株Dou-6生长曲线的测定
分别在250 mL三角瓶中配制50 mL的3种液体种子培养基，种子培养基I为:葡萄糖54g，硫酸铵9 g，三水磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.25 g，pH值7.5。种子培养基2为液体LB培养基，种子培养基3为牛肉膏蛋白胨培养基。121°C灭菌20 min，冷却后分别挑取两环的菌株接种至液态培养基中，于37°C，200 r.mirT1，振荡培养24 h，每隔2 h取样检测菌体在OD600nm下的吸光值，记录菌体在不同培养基下的生长曲线。菌株Dou-6在不同培养基中的生长曲线见图6，由生长曲线我们可以看出，在3种种子培养基中该菌株都是在14-16 h左右首次A9660值达到最大且趋于稳定，表明此时菌体进入稳定期，菌体数量最多。培养基2增长速度最快，最适宜作为发酵种子液，培养时间为15h左右。
[0041]4.连续培养驯化对发酵产物量的影响
500ml三角瓶中配制100mL发酵培养基，接种量为5%，摇瓶发酵，37°C，200 r.min—1发酵60h后，获得第I代发酵液，同时挑取取一定量的发酵液划线，挑取单菌落转接到种子培养基中，细胞增殖后，同样按照5%的接种量转接到500ml含100mL发酵培养基的培养瓶中，摇瓶培养，作为第2代发酵液，循环往复，重复10次发酵，测定每代发酵产物中Y -PGA产量。Y -PGA采用GoTo等方法进行目标产物的纯化和分离，得到的样品用于后续的酸水解及液相色谱(waters 515，美国)测定。利用HPLC对发酵产物的水解液进行液相色谱分析，通过参照谷氨酸标准品图谱对照同时根据峰面积可计算出产量。该菌株10代内的摇瓶发酵产量见图7，随着连续传代培养驯化，该菌株合成Y-PGA的能力有了很大幅度的提升，产量从最初9.13貧/L增加到18.15办1，增幅达98.80%，底物中谷氨酸钠的转化率由30.4%提高到60.5%。且后期产量稳定，保证了后续研究的可靠性。
[0042]5.细菌16S rDNA序列鉴定
将Dou-6号菌株接种到LB液体培养基，摇床培养15h后，取I ml菌液于8000 rpm离心10min后，弃上清，沉淀用CTAB法提取DNA。使用细菌的16S rDNA的引物27F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3，)和 1492R (5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)进行 16S rDNA序列全长扩增。扩增体系:50 ul，包括 TaKaRa Tap (5ug/ul) 0.25 ul, 10XPCR Buffer (Mg2+Free) 5 ul, MgCl2 (25mM) 3ul, dNTP Mixture (各 2.5mM) 4ul，模版 DNA 两份各 Iul，引物I (IOuM) 2ul，引物 2 (IOuM) 2 ul，灭菌去离子水 31.75 ul。PCR 程序:95°C 10 min ；93°C
Imin, 50°C I min,72°C I min 50s，24个循环；最后72°C 5 min。扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成回收测序。在NCBI数据库中BLAST搜索其同源性较高的序列作为参考序列，使用MEGA 5.05软件中的邻接法构建系统进化树。根据NCBI中提供的16SrRNA基因序列，构建进化树进行分析(图8)，其中菌株Dou-6相似度最高的菌株是相似率达 98%。 [0043]6.Dou-6菌株发酵液在土壤保水方面的应用
于河南农业大学校园苗圃内取0-20cm 土壤样品，混合均匀后于阴凉处自然风干，过2mm筛后备用。Dou-6菌株发酵60h后，8000r/min离心10min除去菌体,粘稠上清用去离子水进行2倍和5倍稀释，另外用相同稀释倍数的灭菌发酵培养基作为对照CK2和CK5，去离子水作为空白对照CK0，共5个处理。分别称400g风干过筛的土样，放置于直径16cm的塑料盆中，用上述5种液体调节土壤含水量为最大持水量的75%，25°C恒温培养。取样时间分别为:1 d，4 d，7 d，lld，15 d，破坏性取样，每个处理重复15次。取样时烘干称重，求出不同处理的含水量。(其中添加2、5倍稀释液盆中Y-PGA含量分别为0.270貧、0.10处)。发酵产物稀释后的土壤保水效果见图9。在I d时，2倍、5倍稀释液、CK2、CK5及CKO的含水量基本都维持在18%左右，它们之间无显著差异；在4 d时2倍、5倍发酵液处理土壤含水量分别为9.1%和7.7%，二者达到差异显著水平(P < 0.05);而相应的2倍和5倍培养基稀释液的含水量均为6.8%，去离子水处理含水量最低为6.7%，发酵液保水效果显著高于培养基和去离子水(P < 0.05) ；7 d时各处理含水量都逐渐下降，此时2倍和5倍稀释发酵液处理含水量为4.7%和3.4%，仍显著高于对照培养基和去离子水处理的含水量；第10 d，2倍和5倍稀释液间的土壤含水量仍最高，二者差差异不显著(P > 0.05)，但发酵液处理含水量一直高于培养基和去离子水处理，且含水量差异达到显著(P < 0.05)，第15 d时2倍稀释发酵液含水量高于对照3.5倍维持在3.09%左右。
[0044]本发明以菌株发酵液直接用做土壤保水剂，且表现较好的保水效果。通过直接稀释菌株licheniformis Dou~6的发酵液对土壤的保水效果,表明2倍和5倍稀释液均显著起到保水效果，二者达到差异显著水平。本研究只初步探讨了发酵液的保水性能，植物安全的前提下适宜有效的发酵液添加量，及其适宜的田间施用量仍需要深入研究。关于Y-PGA在土壤上的保水机理，本研究通过观察发现，土壤培养15 d后掀开土层，2个发酵液处理土壤接触紧密，有蜂窝状的小空隙，而培养基、自然土处理土壤较松散，这可能是发酵产物Y-PGA在土层中形成了具有保湿性和粘结性的结构体，在涵养水分的同时能吸附在一起而减小土壤中的孔隙度，阻止了水分蒸发，从而起到了保水剂的作用效果。在农业生产中会时常发生种子和幼苗缺水死亡的现象，因此如果将富含Y-PGA的发酵液开发用作农业保水剂，在播种、拌种、移苗时经过Y-PGA保水剂拌种、蘸根处理，就能大大提升其成活率，预计有广阔的应 用前景。
【权利要求】
1.一株Y-聚谷氨酸产生菌，其特征在于:所述Y-聚谷氨酸产生菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏号为 CGMCC N0.9169。
2.如权利要求1所述的一株Y-聚谷氨酸产生菌的发酵产物在土壤保水中的应用。
【文档编号】C09K101/00GK104017760SQ201410254043
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】李培培, 韩燕来, 汪强, 谭金芳, 姜瑛, 张万旭 申请人:河南农业大学