重组工程介导的谷氨酸棒杆菌atcc 13032的基因敲除方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种重组工程介导的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因敲除方法。
【背景技术】
[0002] 氨基酸是人体生长、营养的必需物质，氨基酸在工业和医药卫生等领域均有着广 泛的应用。每年氨基酸的产量数以千吨计，而大规模生产的氨基酸都是通过微生物发酵而 来。谷氨酸棒杆菌是主要的氨基酸产生菌，目前用于工业生产的氨基酸产生菌多数来源于 谷氨酸棒杆菌的原始菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032经过物理诱变、化学诱变或基因工程 手段而获得。
[0003] 目前氨基酸的产量呈不断上升趋势，但仍不能满足要求，而且能够生产的氨基酸 仍然局限于谷氨酸和精氨酸等少数几种氨基酸。因此提高现有氨基酸的产量并对谷氨酸棒 杆菌进行改造以使之能够生产更多种类的氨基酸具有重要意义。
[0004] 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组序列已在2003年被测序和分析，但仍有许多 未确切的基因组信息未被解释，仍需要大量的实验数据对其中基因功能进行阐明。阐明基 因功能的一个必要的方法就是基因敲除，通过比较原株和基因敲除变株的生理、生化和遗 传等生物学功能即可阐明所研宄的基因在生物体中具有什么功能。
[0005] 经典的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因敲除方法是通过结合转移将突变片段转化 至菌株再通过负筛选而实现。实验步骤为通过PCR扩增待敲除基因左右两侧的同源片段 (大小一般在Ikb以上），克隆测序后，再克隆至含有sacB基因的自杀载体上。将含有此自 杀质粒的大肠杆菌和含有负责基因转移的tra基因（行使基因转移功能）但不同抗性的大 肠杆菌与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032三个菌株混合，在含重组质粒抗性的平板上进行筛选。 由于自杀质粒不能在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的细胞中自主复制，抗性筛选的压力使得 菌株利用自身的重组功能将自杀质粒上的左侧或右侧的同源片段和基因组上的同源片段 之间进行同源重组而整合至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组上。随后将菌株在含有蔗 糖的培养基中进行负筛选。由于整合至基因组上的自杀质粒中含sacB基因，sacB基因编 码的蔗糖6-果糖基转移酶催化蔗糖而生成对菌株有毒性的聚蔗糖，因此在蔗糖的负筛选 之下，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的自身重组系统催化第二轮的同源重组而去除含sacB基 因的质粒部分。第二轮的同源重组可发生在与首次同源重组相同的一侧，也可发生在与首 次同源重组不同的一侧，如为前者则得到谷氨酸棒杆菌ATCC 13032原株，如为后者则得到 目的基因敲除变株。由此可见，这种经典的基因敲除方法耗时费力（需要多个基因克隆和 测序步骤）、繁琐（需要多个菌株的参与和多重实验操作步骤），因为最终的筛选可同时得 到原株和变株，对某些基因而言，基因敲除效率常常较低，需筛选大量的克隆才能得到目的 的基因敲除变株，由此加大了实验的难度。
【发明内容】
[0006] 为简捷快速和高通量地实现对谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因进行敲除，从而 为研宄基因功能及至获得高产的氨基酸产生菌或生产多种其他种类的氨基酸奠定基础，本 发明提供了一种利用重组工程手段对谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因进行敲除的方法。
[0007] 本发明所涉及的一种重组工程介导的对谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的进行基因敲 除的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)通过聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除的目的基因500bp同源序 列、中间为卡那霉素抗性基因的线性底物DNA片段；
[0009] ⑵线性底物DNA片段电转化至由异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质 粒PLS3023中的重组酶基因 red α和red β表达的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032细胞中。在 卡那霉素筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株；
[0010] (3)将基因敲除变株在含10%蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的 质粒 PLS2023。
[0011] 本发明使用重组工程方法来实现所转化的线性片段和基因组上同源片段之间的 同源重组。重组工程是利用重组酶催化同源片段之间的重组而进行基因克隆和基因修饰的 一种生物技术手段。重组工程避免了繁琐的基因克隆以及其他一些操作步骤。最常用的重 组酶基因是来源自λ B莖菌体的、位于一个操纵元上的red a，red β和red γ基因。red α基 因编码5' 一 3' DNA外切酶，其作用于转化的双链线性DNA分子而得到DNA单链分子；red β 基因编码重组酶，负责催化同源重组；redY基因编码Gam蛋白，Gam蛋白可抑制内源性核酸 酶对外源DNA片段的降解。
[0012] 本发明使用的是reda和redf3这两个基因，因为实验发现在本谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032基因敲除实验中，不能加入redy基因，否则不能构建目的质粒。本发明所使用 的、表达重组酶基因 reda和redf3的质粒pLS3023是由如下方法获得：以pSNIOl为模板， SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2为引物PCR扩增得到含核糖体结合位点的1.5kb的DNA片段， 以PstI和BamHI酶切后，克隆至以同样酶切的载体pBluescript II KS(-)得到重组克隆 PLS2333。PstI和BamHI酶切分离pLS2333中的插入片段克隆至以同样酶切的pEKEx3获得 PLS3005。以λ噬菌体DNA为模板，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 3为引物PCR扩增得到1.5kb 的red α和red β DNA片段，以SacI和XbaI酶切后，克隆至以相同酶切的pBluescript Π KS(-)获得pLS3014。SacI和XbaI酶切分离pLS3014的插入片段、XbaI和BamHI酶切 分离PKsacB的插入片段，二者和SacI和BamHI酶切的pBluescript II KS (-)连接后获得 PLS3016。NcoI和BamHI酶切分离pLS3016的插入片段克隆至以相同酶切的pLS3005获得 PLS3023。
[0013] 将重组酶基因 red α和red0自λ噬菌体扩增后置于在pTac启动子之下，pTac 启动子受调节基因 IacIq所严谨调控。在环境中不含有诱导剂IPTG时，IacIq基因编码抑 制蛋白而抑制PTac启动子的表达；当环境中含有IPTG时，IPTG和LacIq结合而解除后者 其对pTac的抑制，pTac因此驱动red α和red β的表达而行使同源重组的功能。
[0014] 在获得基因敲除变株后，表达重组酶基因的质粒常常去除以简化背景和减少代谢 负担。为实现这一目的，PLS3023同时克隆有sacB基因，这样含pLS3023的菌株在10%蔗 糖的培养基上生长时，sacB基因发挥负筛选作用，扩增的子代细胞中如含有sacB基因则不 能生存，因而通过培养即可获得质粒LS3023消除的基因敲除菌株。
[0015] 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因上的crtI2基因和upp基因敲除证明了本重组工 程方法的可行性。crtI2基因在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组上的基因编号为cg0721， 为八氢番茄红素合成酶基因，参与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032黄色色素的形成。黄色色素是 细胞分化和发酵中的关键产物，具重要生理意义。upp基因在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基 因组上的基因编号为cg〇786,为尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，是磷酸核糖的生物合成中 的关键基因，对氨基酸的产生和调节非常重要。
[0016] 本发明的重组工程介导的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因敲除方法，采用简便的 PCR和电转化辅以卡那霉素抗性筛选，无需基因克隆等分子生物学及其他一些操作步骤。方 法简便快捷，将在研宄基因功能及至氨基酸的生产方面有着重要的应用。
【附图说明】
[0017] 图1重组工程法介导的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因敲除示意图。
[0018] GOI表示待敲除的目的基因，Hl和H2表示目的基因的上游和下游的500bp片段， neo表示卡那霉素抗性基因，pLS3023中的重组酶red α和red0在IPTG诱导下表达，催化 线性片段和基因组上同源片段之间的同源重组。在卡那霉素的抗性筛选之下获得卡那霉素 抗性基因取代目的基因的基因敲除变株。基因敲除变株的基因型由上游整合位点一端的Pl 引物和卡那霉素抗性基因中间的P2、卡那霉素基因中间的P3和下游整合位点一端的P4引 物这两对引物的PCR反应所验证。所得菌株在含10%蔗糖的培养基中培养，负筛选作用使 PLS3023 失去。
[0019] 图2是crt2基因敲除变株基因型分析的凝胶电泳结果
[0020] [1] λ/HindIII DNA 分子量标准（自上而下）：23· 1,9. 4, 6. 6, 4. 4, 2. 3, 2. Okb
[0021] [2]以13032原株基因组DNA为模板，R1417-R1418PCR扩增得到2360bp ;
[0022] [3]以crtI2基因敲除变株基因组DNA为模板，R1417-R1419PCR扩增得到1038bp ;
[0023] [4]以crtI2基因敲除变株基因组DNA为模板，R1420-R1418PCR扩增得到1324bp ;
[0024] [5]以crtI2基因敲除变株基因组DNA为模板，R1417-R1418PCR扩增得到2342bp ;
[0025] [6]DL2000DNA 分子量标准（自上而下）：2. 0, 1. 0, 0· 75, 0· 5, 0· 25, 0· lkb。
[0026] 图3是upp基因敲除变株基因型分析的凝胶电泳结果
[0027] [1] λ/HindIII DNA 分子量标准（