一种从谷氨酸棒杆菌发酵液中分离提取l-丝氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从谷氨酸棒杆菌发酵液中分离提取L-丝氨酸的方法，包括如下步骤：对发酵液进行絮凝，固液分离后的提取液经活性炭吸附脱色，再通过超滤脱除大分子，并采用阳离子树脂吸附氨基酸，利用氨水进行洗脱。洗脱液经真空浓缩，并加入乙醇进行降温结晶，获得L-丝氨酸晶体。本发明方法，提取效率高，单程提取率可达56%以上，通过母液回收再处理，综合提取率可达到80%以上。本发明方法易于工业化实现，提取成本相对低廉，可以进行大批量处理。
【专利说明】一种从谷氨酸棒杆菌发酵液中分离提取L-丝氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取工艺，特别涉及从谷氨酸棒杆菌的发酵液中提取L-丝氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]L-丝氨酸(L-serine ,简写L_ser),分子式为C3H7NO3,化学结构为HO-CH2CH (NH3)-COOH,分子量105.10，化学名为α-氨基-β-羟基丙酸。L-丝氨酸属于非必须氨基酸，系生糖氨基酸，在细胞增殖过程中有着重要作用，在细胞生长时L-丝氨酸是嘌呤核苷酸与磷酸脱氧胸苷合成的主要的一碳单元供体，同时也是其他氨基酸(如半胱氨酸、牛磺酸)、脂类信使分子(如磷脂酰丝氨酸、神经酰胺)以及神经调质(甘氨酸、D-丝氨酸)的前体物质。L-丝氨酸在食品工业、医药、化妆品中有广阔的应用，其市场需求量不断增加。
[0003]目前，国内外生产L-丝氨酸的方法主要有化学合成法，蚕丝水解法，酶法，前体发酵法等。国内鲜有直接利用微生物发酵直接生产L-丝氨酸的报道。江南大学从自然界中筛选到一株能够直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌{Corynebacterium
，该实验室对这株谷氨酸棒杆菌展开了系统的研究。罗玉常等通过分子生物学手段构建了一株L-丝氨酸C glut ami cum高产菌33a Δ SSA (菌种保藏号),经发酵优化,其发酵产L-丝氨酸水平已稳定达到25g/L以上，为满足中试和规模化发酵，需要研究L-丝氨酸的提取精制工艺。
[0004]早期的L-丝氨酸的精制工艺主要针对的是蚕丝、毛发等水解液等原料液，由于料液中同时含有多种其他氨基酸以及杂质，提取工艺复杂，收率低，尤其是碱法水解工艺中，还含有较多的D -丝氨酸，需要进行拆分和转型(冯容保.改进的离子交换法提取1-丝氨酸，化学通讯，2000.04 ;一种从缫丝下脚丝提取L-丝氨酸的生产工艺，中国专利201010507725.1)。由于水解法提取工艺污染大、成本高，目前仅有少量生产。近年来，利用酶法工艺生产L-丝氨酸也有报道，如采用采用丝氨酸羟甲基转移酶，以甘氨酸和甲醛为底物，以四氢叶酸和磷酸吡哆醛为辅助因子可以获得L-丝氨酸，利用超滤和离子吸附等技术可以完成提取分离(韦平和等.酶法生产L-丝氨酸的分离纯化，中国新药杂志，2012.20)，但也存在工艺复杂等问题。而且酶法转化液与发酵液在产物浓度、杂质组成和含量方面存在较大差别，因此在方法上不能简单套用。
[0005]C.glut ami cum发酵液中主要的氨基酸杂质是缬氨酸、丙氨酸，其他杂氨酸含量较少，非氨基酸类杂质主要是菌体、色素、蛋白以及残留的培养基成分。其体系组成与水解液相比要相对简单，也不存在D型氨基酸，但缬氨酸、丙氨酸与丝氨酸在性质上较为接近，分离较为困难。因此，需要针对C glutamicum发酵液的特点，建立一种提取效率高、分离成本低的提取工艺，以满足发酵法L-丝氨酸的生产。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于一种从谷氨酸棒杆菌的发酵液中提取L-丝氨酸的方法。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种从谷氨酸棒杆菌的发酵液中提取L-丝氨酸的方法，包括如下步骤:
1)絮凝:在谷氨酸棒杆菌发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，之后固液分离去除絮凝物，得清液；
2)脱色:在清液中加入脱色吸附剂，之后固液分离，得脱色液；
3)超滤:将脱色液超滤，截留分子量在2000~5000Da，合并超滤液；
4)吸附与洗脱:将超滤液 通过阳离子交换柱以吸附氨基酸，之后洗脱，得洗脱液；
5)浓缩:将洗脱液浓缩，得浓缩液；
6)结晶:向浓缩液中加入乙醇，混合均匀，之后冷却至5~10°C，使L-丝氨酸结晶析出，收集析出的晶体并洗涤干净；
7)干燥:将洗涤干净的L-丝氨酸干燥，得到成品。
[0008]作为本发明的进一步改进，絮凝操作时，先将发酵液的pH调节为3~5，之后加入絮凝剂聚丙烯酰胺，使其在发酵液中的浓度为100~200 mg/ml。
[0009]作为本发明的进一步改进，脱色时采用的脱色吸附剂为粉末活性炭。
[0010]作为本发明的进一步改进，阳离子交换柱中填充的离子交换树脂为732强酸性阳离子交换树脂。
[0011]作为本发明的进一步改进，吸附与洗脱操作中使用的洗脱剂为氨水。更进一步的，氨水的浓度为0.2~0.5mol/L。
[0012]作为本发明的进一步改进，结晶操作时，乙醇在浓缩液中的体积浓度为40~80%。
[0013]作为本发明的进一步改进，采用乙醇溶液洗涤L-丝氨酸结晶。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明方法，可以高效低成本地从谷氨酸棒杆菌的发酵液中提取L-丝氨酸，得到的L-丝氨酸纯度高。同时，本发明方法不影响从发酵液中提取其他氨基酸，有利于发酵液的综合利用。
[0015]本发明采用絮凝与离心分离法进行菌体去除，再通过超滤去除大分子物质，继而采用离子交换法进行氨基酸吸附和解吸附，并利用反渗透工艺对解吸液进行浓缩，最后通过冷却结晶工艺获得L-丝氨酸。本发明方法，提取效率高，单程提取率可达56%以上，通过母液回收再处理，综合提取率可达到80%以上。本发明方法易于工业化实现，提取成本相对低廉，可以进行大批量处理。
[0016]上述工艺的主要创新在于:一是利用超滤工艺去除大分子，减少杂质对离子交换树脂的污染，提高离子交换的效率，减少离子交换的工艺环节；二是利用反渗透工艺进行浓缩，减少真空浓缩的生产负荷，节能效果显著；三是利用冷却结晶工艺获得高纯度L-丝氨酸，而丙氨酸、缬氨酸在此条件下留在母液中，可以作为副产物进行回收。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是L-丝氨酸在纯水和乙醇溶液中的溶解度曲线；
图2是不同氨基酸的洗脱曲线。【具体实施方式】
[0018]一种从谷氨酸棒杆菌的发酵液中提取L-丝氨酸的方法，包括如下步骤:
1)絮凝:在谷氨酸棒杆菌发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，之后固液分离去除絮凝物，得清液；
2)脱色:在清液中加入脱色吸附剂，之后固液分离，得脱色液；
3)超滤:将脱色液超滤，截留分子量在2000~5000Da，合并超滤液；
4)吸附与洗脱:将超滤液通过阳离子交换柱以吸附氨基酸，之后洗脱，得洗脱液；
5)浓缩:将洗脱液浓缩，得浓缩液；
6)结晶:向浓缩液中加入乙醇，混合均匀，之后冷却至5~10°C，使L-丝氨酸结晶析出，收集析出的晶体并洗涤干净；
7)干燥:将洗涤干净的L-丝氨酸干燥，得到成品。
[0019]作为本发明的进一步改进，絮凝操作时，先将发酵液的pH调节为3~5，之后加入絮凝剂聚丙烯酰胺，使其在发酵液中的浓度为100~200 mg/ml。通常情况下，加入絮凝剂之后，搅拌20~60min，静置I~8h后，离心分离絮凝物即可去除绝大部分大分子杂质。
[0020]作为本发明的进一步改进，脱色时采用的脱色吸附剂为粉末活性炭。一般而言，在絮凝后的上清液中加入5~50g/L的粉末状活性炭，20~80°C的条件下，搅拌20~60min，过滤或者离心即可获得较好的脱色效果。
[0021]超滤可以使用通用的陶瓷超滤膜或有机超滤膜装置。为提高利率，截留液可多次加入纯化水进行洗涤,滤出后合并滤液。
[0022]作为本发明的进一步改进，阳离子交换柱中填充的离子交换树脂为732强酸性阳离子交换树脂。控制适宜流速和加入体积，使超滤液中的L-丝氨酸组分得到充分吸附。通过对流出液进行监测，到吸附饱和后停止加料，用柱体积1.5~3.0倍的纯化水进行洗涤，再采用浓度为0.2~0.5mol/L的氨水洗脱，通过监测洗脱液中的氨基酸含量和组成，对氨水浓度和流速进行优化，控制适宜的条件使L-丝氨酸流出峰形对集中。收集L-丝氨酸集中的洗脱峰。
[0023]浓缩时可利用反渗透装置或者真空多效浓缩器，或者上反渗透与多效浓缩联用的方式对洗脱液进行浓缩，适宜的浓缩液中固形物含量在20~40%。
[0024]作为本发明的进一步改进，吸附与洗脱操作中使用的洗脱剂为氨水。更进一步的，氨水的浓度为0.2~0.5mol/L。
[0025]因为L-丝氨酸极易溶解于水,在5°C下饱和溶液中，L-丝氨酸含量仍有18.9%,因此单纯采用降温方式进行结晶，其回收率低。而在5%溶液体系下，其饱和溶液中L-丝氨酸含量降到2.5%。L-丝氨酸在纯水和乙醇溶液中的溶解度如表1所示，L-丝氨酸在纯水和乙醇溶液中的溶解度曲线如图1所示。
[0026]表1 L-丝氨酸在纯水和乙醇溶液中的溶解度(g)
【权利要求】
1.一种从谷氨酸棒杆菌的发酵液中提取L-丝氨酸的方法，包括如下步骤: 1)絮凝:在谷氨酸棒杆菌发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，之后固液分离去除絮凝物，得清液； 2)脱色:在清液中加入脱色吸附剂，之后固液分离，得脱色液； 3)超滤:将脱色液超滤，截留分子量在2000~5000Da，合并超滤液； 4)吸附与洗脱:将超滤液通过阳离子交换柱以吸附氨基酸，之后洗脱，得洗脱液； 5)浓缩:将洗脱液浓缩，得浓缩液； 6)结晶:向浓缩液中加入乙醇，混合均匀，之后冷却至5~10°C，使L-丝氨酸结晶析出，收集析出的晶体并洗涤干净； 7)干燥:将洗涤干净的L-丝氨酸干燥，得到成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:絮凝操作时，先将发酵液的PH调节为3~5，之后加入絮凝剂聚丙烯酰胺，使其在发酵液中的浓度为100~200 mg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:脱色时采用的脱色吸附剂为粉末活性炭。
4.根据权利要求1所 述的方法，其特征在于:阳离子交换柱中填充的离子交换树脂为732强酸性阳离子交换树脂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:吸附与洗脱操作中使用的洗脱剂为氨水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:结晶操作时，乙醇在浓缩液中的体积浓度为40~80%。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于:浓缩操作中，将洗脱液浓缩至固含量为20~40%。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:氨水的浓度为0.2~0.5mol/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:采用乙醇溶液洗涤L-丝氨酸结晶。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:浓缩时采用反渗透法进行浓缩。
【文档编号】C07C227/40GK103539688SQ201310508490
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】许正宏, 史劲松, 郭雯, 方佳茂, 陈伟滨, 张晓梅, 罗玉常, 朱勤建 申请人:广东环西生物科技股份有限公司