一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用微生物提高精氨酸产量的方法，尤其涉及一种利用谷氨酸棒 杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法。
【背景技术】
[0002] L-精氨酸是一种含有胍基的碱性氨基酸，在哺乳动物中是半必需或条件性必需氨 基酸。近年来研究显示，L-Arg能促进各种免疫分子的合成从而可抑制癌细胞的生长，促进 尿液循环并降低血液中氨的含量，同时作为生成NO的前体代谢产物，L-Arg还具备放松和 扩张血管等重要功能。因此，L-Arg在医药和食品方面有广泛的应用价值，备受国内外研发 和生产机构的关注。目前，全世界L-Arg年需求量在15000吨以上，而实际年产量却不到 8000吨，生产商主要集中在日本、美国和欧洲等国家，L-Arg在我国还主要依赖进口，是药 用氨基酸生产的瓶颈，每年在进口 L-Arg这一个产品上的费用达4到5亿元人民币，所以加 强L-Arg的生产研究是很有现实意义的。
[0003] 目前L-精氨酸发酵工程菌株主要集中于棒杆菌属，特别是C. glutamicum和与 其DNA序列极其类似的C. crenatumo国内外有关提高精氨酸产量的研究已有很多报道， 对其生产菌分子育种策略主要是对其合成途径的疏通、截流、增流等方法。如，Ikeda等 通过解除反馈阻遏和反馈抑制的方法对传统的精氨酸产生菌种C. glutamicum A-27、 C. glutamicum I_30、C. glutamicum D-77与野生型C. glutamicum的精氨酸操纵子进行测序 比对分析，发现这三株菌中分别存在argB26、argB31和argR123等点突变。为探究该突变对 C. glutamincum发酵产精氨酸的影响，Ikeda等以不产精氨酸的野生型C. glutamicum为亲 本，对其argB的26和31位点分别或组合突变并与argR的致死突变结合，结果发现argB26、 argB31两个位点发生点突变且负调控蛋白ArgR缺失时，其精氨酸产量发生了零的突破，达 到8. 76g/L。Xu等通过PCR方法获得了与精氨酸合成相关的基因簇argCJBDF-argGH，并将 其克隆至穿梭表达质粒PJC1，再导入C. crenatum SYPA5-5,利用该基因簇自身的启动子实 现了 arRCJBDF-argGH在C. crenatum SYPA 5_5体内表达上调，其产精氨酸能力较亲本提高 了 24.9%。三羧酸循环代谢支路生成的谷氨酸不仅是精氨酸合成的前体，而且还是脯氨酸 合成的前体，脯氨酸与精氨酸的合成形成竞争关系。因此，切断脯氨酸合成支路有利于细菌 体内代谢流向精氨酸合成方向。李小曼等运用同源重组技术构建了一株缺失了 γ-谷氨酰 激酶编码基因（proB)的工程菌C. crenatum 8-193,该菌种体内γ-谷氨酰激酶活性严重下 降，精氨酸产量却能达到13. 78g/L，较出发菌株提高了 13. 6%。
[0004] 但目前未见敲除dtsRl基因、在对数生长初期添加吐温40或吐温80及在发酵培 养基中添加吐温80或油酸或二者混合物以提高精氨酸产量的报道。精氨酸的前体物质是 谷氨酸，而谷氨酸的前体物质是三羧酸循环的中间代谢产物α-酮戊二酸，α -酮戊二酸可 在 α -酮戊二酸脱氢酶复合物（oxoglutarate dehydrogenase complex，0DHC)进一步循 环为琥泊酰辅酶A，而ODHC的编码基因 sucB、odhA和IpdA受dtsRl基因的正调控。当敲 除dtsRl基因，sucB、odhA和IpdA基因的转录水平大幅下降，这有利于α -酮戊二酸流向 谷氨酸并进一步流向精氨酸；同时，发现添加 Tween 40不仅有利于降低sucB、odhA和IpdA 基因的转录水平，而且提高了合成NADPH的磷酸戊糖途径相关基因（如zwf基因）的表达 水平，且通过NADPH及NAD/NADPH比值的测定，证实NADPH的供应得到了大幅提高，而Imol 精氨酸的合成需要消耗3mol NADPH。因此，二者共同促进了精氨酸产量的大幅提高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的 方法。
[0006] 本发明是这样实现的，一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方 法，其实现的技术步骤为，1、dtsRl基因敲除同源臂的构建及敲除质粒的构建：设计敲除谷 氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌dtsRl基因的上下同源臂引物并分别在上下臂引物的5 '端和3' 端加上HindIII和XbaI限制性内切酶位点，分别通过PCR技术扩增dtsRl的上下同源臂， 采用DNA纯化试剂盒纯化dtsRl的上下同源臂，并等摩尔混合后进行重叠 PCR获得dtsRl 基因敲除同源臂；通过HindIII和XbaI双酶切，将dtsRl基因敲除同源臂克隆至蔗糖致死 质粒pK18mobsacB中，获得敲除质粒pK18mobsacB_ Δ dtsRl，并将其分别电转至谷氨酸棒杆 菌和钝齿棒杆菌；
[0007] 2、诱导敲除了 dtsRl基因的谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌高产精氨酸：先在28~ 30°C种子培养基中活化谷氨酸棒杆菌或钝齿棒杆菌，培养14~16h后以1 %~2% v/v的接 种量接种至发酵培养基中，在28~30°C发酵生长至对数生长初期加入lmg/mL~15mg/mL 吐温40或吐温80诱导高产精氨酸，其中种子培养基配方如下：葡萄糖30g/L，玉米浆25g/ L，硫酸铵 45g/L，磷酸二氢钾 0. 5g/L，MgS04 ·7Η20 0. 5g/L，尿素 I. 5g/L，pH = 7. 2 ;发酵培养 基配方如下：葡萄糖120g/L，玉米浆25g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0. 05g/L，MgS04 ·7Η20 0. 5g/L，并加入了 0. 5g/L~2. Og/L油酸或吐温80或二者混合物，如摇瓶发酵则需加30g/ L CaCO3;
[0008] 3、高密度发酵：对谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌重组菌进行高密度发酵，前期菌体 生长阶段的参数为温度28~30°C，溶氧控制在18~22 %的饱和溶氧浓度，pH为6. 5~ 7. 5 ;待OD6。。至5-6时，加吐温40诱导，溶氧控制在28~32%左右的饱和溶氧浓度，pH 6. 5~7. 5,继续培养70~108h收集菌液。
[0009] 所述的诱导剂是吐温40,发酵培养基中是添加了油酸或吐温80或二者混合物。
[0010] 所述谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌的dtsRl基因被敲除。
[0011] 本发明的技术效果是：本发明将dtsRl基因敲除后，使其调控的α -酮戊二酸脱氢 酶复合物（oxoglutarate dehydrogenase complex，0DHC)的转录水平大幅下降，使α-酮 戊二酸流向了精氨酸；同时在发酵培养基中添加吐温80或油酸或二者混合物弥补了 dtsRl 缺失造成的营养缺失，在发酵培养对数生长初期添加吐温40诱导了磷酸戊糖途径的基因 转录水平大幅提高，从而为精氨酸的合成提供了足量的NADPH，省去了采用其他繁琐的分子 育种手段来提高NADPH供应及提高三羧酸循环途径中α -酮戊二酸的其他积累方法。
【附图说明】
[0012] 图1为PCR方法扩增敲除dtsRl上下同源臂及重叠 PCR图。
[0013] 图2为敲除dtsRl的单交换图。
[0014] 图3为敲除dtsRl的双交换子的筛选图。
[0015] 图4为荧光定量PCR图。
[0016] 在图1中，1为上臂片断；2为下臂片断；3为重叠片断；4为DL2000标准分子量。
[0017] 在图2中，M为DL2000标准分子量；1为阴性对照；2-3为阳性对照；4-6为 dtsRl-single-F和dtsRl-down-R引物单交换子筛选片断。
[0018] 在图3中，M为DL2000标准分子量；1-2为阴性对照；3、5、7和9为dtsRl-inner check-F和dtsRl-inner check-R引物筛选的双交换子片断；4、6、8和10为dtsRl-up-F和 dtsRl-down-R引物双交换子筛选片断。
【具体实施方式】
[0019] 下面将结合附图1-4来详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好 地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。
[0020] 实施例1
[0021] 重组菌C. glutamicumA dtsRl和C. crenatumA dtsRl的构建过程及在摇瓶规模下 精氨酸生产的方法，包括以下步骤：
[0022] (1)敲除dtsRl质粒的构建及其重组菌的构建：根据C. glutamicum(登录号： BX927147. 1)和 C crenatum(登录号：NZ_AQPS01000045. 1)中的 dtsRl 上下同源序列设 计引物，引物序列见表1(双下划线为限制性内切酶位点，单下划线为重叠序列），分别以 C. glutamicum和C. crenatum的单菌落为PCR反应模板，PCR反应条件为95°C预变性lOmin， 95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30个循环，最后在72°C延伸lOmin，扩增出 二条与预期大小相符的DNA片段，参照图1所示，泳道4为DNA marker，泳道1、2分别为 dtsRl的上下同源臂；上下同源臂纯化回收、等摩尔数混合后，再通过重叠 PCR反应获得敲 除dtsRl重叠片段，其PCR反应条件为95°C预变性lOmin，95°C变性10s，56°C退火30s，72°C 延伸1.5min，共30个循环，最后在72°C延伸10min，图I泳道3为重叠 PCR结果。
[0023] 重组菌的构建：将获得的敲除dtsRl同源片段，通过HindIII和XbaI双酶切，克隆 至经同样双酶切的鹿糖致死质粒pK18mobsacB中，