菌丝霉素蛋白的表达方法及其在抑痤疮丙酸杆菌中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及菌丝霉素蛋白的表达方法及其在抑痤疮丙酸杆菌中的应用。
【背景技术】
[0002]痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，是皮肤科最常见的疾病之一，其发病主要与性激素水平、痤疮丙酸杆菌增殖、皮脂腺大量分泌，毛囊皮脂腺导管的角化异常及炎症等因素相关。好发于青春期，有80%?90%的青少年患过痤疮。虽然痤疮是有自愈倾向的疾病，但是痤疮本身以及痤疮治疗不及时引起的瘢痕可以严重影响患者的生活质量，造成患者的精神压力和经济负担，需引起关注。痤疮好发于面颊、额部、颊部和鼻唇沟，其次是胸部、背部和肩部。目前缺乏有效的痤疮治疗方法，往往很难收到良好的效果。
[0003]抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，多具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌等特点。迄今为止，研究者已经从细菌、真菌、两栖类、昆虫、植物、哺乳动物乃至人体中发现并分离获得了具有抗菌活性的多肽。由于这些多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibacterial peptides, ABP”。并随着研究工作的深入，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有杀伤作用。
[0004]Plectasin也称为菌丝霉素，是2005年首次由Hans-Henrik Kristensen课题组从叫做腐生子囊菌假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)的一种真菌中分离得到。体外抑菌试验表明，Plectasin对于多种细菌具有很高的杀菌活性。进一步体内抑菌试验表明，在肺炎链球菌感染小鼠引起的腹膜炎和肺炎模型中，Plectasin的疗效分别与万古霉素和青霉素相当。此外，Plectasin具有选择性杀灭作用，安全性高。Plectasin与细菌细胞壁形成的前体物质Lipid II具有很强的亲和性，可以通过与Lipid II结合阻止病菌细胞壁的形成，从而阻止病菌繁殖。Plectasin独特的作用机制不易诱导产生耐药性菌株。
[0005]虽然现有信息中的公开了 Plectasin可以抑制多种细菌的生长，但其是否能够抑制痤疮丙酸杆菌的生长，是否可以用于痤疮的治疗，仍为未知。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供菌丝霉素蛋白在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种菌丝霉素蛋白的表达方法，包括以下步骤:
1)根据菌丝霉素NZ2114的蛋白序列SEQID NO: 1，合成优化的编码菌丝霉素NZ2114蛋白的基因序列SEQ ID NO:2 ;将所得的菌丝霉素基因序列SEQ ID N0:2连接到酵母表达载体PPicZa的a -factor信号肽下游的多克隆位点，将构建好的重组表达载体转化到毕赤酵母GSl 15中，筛选出阳性重组菌；
2)将上步筛选出的阳性重组菌进行诱导表达培养，提取并纯化所表达的目的蛋白，即为菌丝霉素蛋白。
[0008]菌丝霉素蛋白在制备抑痤疮丙酸杆菌药剂中的应用。
[0009]菌丝霉素蛋白在制备治疗痤疮药剂中的应用。
[0010]进一步的，上述痤疮为由痤疮丙酸杆菌引发的痤疮。
[0011]—种治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂，该菌丝霉素凝胶剂由以下质量百分比的成分组成:菌丝霉素0.001%?0.01%，卡波姆940 0.5%?1.0%，甘油5%?10%，尼泊金甲酯0.05%?0.20%，尼泊金丙酯0.01%?0.1%，三乙醇胺1.0%?2.0%，余量为水
一种治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂的制备方法，包括以下操作步骤:
1)将菌丝霉素蛋白用蒸馏水溶解备用；
2)尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、甘油加入到蒸馏水中，加热溶解完全，然后加入卡波姆940，使其充分溶胀，搅拌均匀，加入三乙醇胺，调节pH值至5.8?6.2，最后加入菌丝霉素蛋白溶液，搅拌均匀，即可获得治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂；
上述所制得的菌丝霉素凝胶剂中含有以下质量百分比的成分:菌丝霉素0.001%?0.01%，卡波姆940 0.5%?1.0%，甘油5%?10%，尼泊金甲酯0.05%?0.20%，尼泊金丙酯
0.01%?0.1%，三乙醇胺1.0%?2.0%，余量为水。
[0012]本发明的有益效果是:
本发明首次发现菌丝霉素具有抑制痤疮丙酸杆菌的作用，可用于制备痤疮丙酸杆菌的抑菌剂；可进一步用于治疗痤疮等皮肤炎症，尤其是对目前难以治疗的由痤疮丙酸杆菌引发的痤疮等皮肤炎症具有良好的疗效。
【附图说明】
[0013]图1为菌丝霉素蛋白的RP-HPLC分析图；
图2为纯化后的菌丝霉素蛋白的质谱检测图；
图3为菌丝霉素蛋白对金黄色葡萄球菌26003的抑制情况；I为20 μ L的I μ g/uL菌丝霉素蛋白；2为40 yL的I μ g/ μ L菌丝霉素蛋白；3为60 yL的的I μ g/ μ L菌丝霉素蛋白；4为80 μ L的的I μ g/ μ L菌丝霉素蛋白；5、为100 μ L的的I μ g/ μ L菌丝霉素蛋白；“6”为无菌水，作为阴性对照；“7”为氨苄青霉素Amp，作为阳性对照；
图4为菌丝霉素蛋白对痤疮丙酸杆菌的抑制情况；1为20 μ L的I μ g/uL菌丝霉素蛋白；2为40 yL的I μ g/ μ L菌丝霉素蛋白；3为60 yL的的I μ g/ μ L菌丝霉素蛋白；4为80 μ L的的I μ g/μ L菌丝霉素蛋白；5、为10yL的的I μ g/μ L菌丝霉素蛋白；“6”为无菌水，作为阴性对照；“7”为氨苄青霉素Amp，作为阳性对照；
图5为本发明菌丝霉素凝胶剂治疗面部痤疮前后的对比图；A、B分别为痤疮患者正面治疗前后对比图；C、D为左侧面治疗前后的对比图；E、F为右侧面治疗前后的对比图；其中B、D、F为红色区图片，以观察皮下毛细血管分布情况；
图6为本发明菌丝霉素凝胶剂治疗面部痤疮前后的对比图；A、B分别为痤疮患者正面治疗前后对比图；C、D为左侧面治疗前后的对比图；E、F为右侧面治疗前后的对比图；其中B、D、F为红色区图片，以观察皮下毛细血管分布情况。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0015]实施例1菌丝霉素蛋白的表达 I)重组表达载体的构建及重组菌的筛选
根据腐生子囊菌假黑盘菌中NZ2114菌丝霉素的蛋白序列SEQ ID N0:1，合成优化的编码菌丝霉素 NZ2114 的基因序列 CTCGAGAAAAGAGGITTCGGTTGTAACGGAC CTTGGAACGAAGATGATCTGAGGTGCCATAATCACTGTAAGTCAATCAAGGGATATAAGGGAGGTTACTGTGCCAAAGGTGGATTTGTTTGCAAATGCTACTAATAAGGATCCTAGGCSEQ ID NO: 2)。将所得的菌丝霉素基因序列(SEQ ID NO: 2)连接至IjpUC载体上，再双酶切连入酵母表达载体pPicZ α的a-factor信号肽下游，利用Zeocin(博来霉素)作为抗性标记进行重组子筛选；然后将构建好的重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中，在酵母表达系统中进行融合分泌表达，重组毕赤酵母菌能在甲醇诱导下高效持续的表达。其中的阳性重组酵母菌的筛选为，先通过Zeocin (博来霉素)筛选出阳性重组子，并通过测序验证正确，将阳性重组子进行目的蛋白表达，经SDS-PAGE分析筛选出高效表达菌丝霉素的重组酵母菌。
[0016]2)菌丝霉素蛋白的表达和纯化
将筛选得到的能高效表达菌丝霉素的阳性重组酵母菌转接至BNGY培养基，30°C培养24小时后，转接到诱导培养基BMMY中，30°C继续培养，每24小时加入2%甲醇诱导，摇瓶培养72小时后，将培养基12000rpm/min离心30分钟后，取上清，弃沉淀；上清经饱和度为45?55%的过硫酸铵在4°C沉淀完全，12000rpm/min离心