一种高产丙酸詹氏丙酸杆菌工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产丙酸詹氏丙酸杆菌工程菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明采用分子手段，是以詹氏丙酸杆菌为宿主，过量表达来自肺炎克雷伯氏菌的苹果酸脱氢酶基因mdh，或者同时还过量表达来自肺炎克雷伯氏菌的甘油脱氢酶基因gldA。与出发菌株相比，过表达苹果酸脱氢酶的重组混和共表达甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶的重组菌的丙酸产量分别为为36.09和39.43g/L，比出发菌株提高了33.91％和46.3％。本发明为工业生物技术改造詹氏丙酸杆菌以及提高丙酸发酵生产能力提供了新的思路。
【专利说明】一种高产丙酸詹氏丙酸杆菌工程菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高产丙酸詹氏丙酸杆菌工程菌及其应用，属于遗传工程领域。
【背景技术】
[0002]丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除莠剂合成、有机合成中间体等方面。2006年世界丙酸总生产能力在35万吨/年左右，2008年达到50万吨/年。美国是世界上最大的丙酸生产及消费国。目前我国丙酸实际年产量只有200吨左右，远远不能满足实际的市场需求，每年仍需大量进口来弥补国内的空缺。
[0003]詹氏丙酸杆菌(Propionibacteriumjensenii)属于丙酸杆菌属，为厌氧菌,是一类G+、不产芽孢、不运动、接触酶阳性的厌氧菌。菌落呈现白色、黄色或者褐红色。一般情况下，最适pH为6.5~7.5,最适生长的温度为28°C~37°C。
[0004]丙酸的生产方法有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法是以石油等化工产品为原料，经过加温、加压利用催化剂合成丙酸的方法，该方法是工业级规模上丙酸的主要生产方法。微生物发酵法是丙酸菌在常温、常压下利用一般营养源通过自身代谢产生丙酸。由于微生物发酵生产丙酸能降低对石油等不可再生能源的依赖性，减轻对环境造成的压力，因此，在当前全世界面临环境污染、能源短缺的严峻情况下，微生物发酵法生产丙酸为丙酸合成提供了新的思路，同时得到了越来越多研究者的关注。但是微生物法生产丙酸仍然存在成本高，丙酸产量低等缺点。丙酸杆菌的主要碳源是甘油，然而在其代谢途径中，詹氏丙酸杆菌对甘油的利用率并不高，从而导致碳源转化成产物的效率低下，最终导致丙酸产量低。因此，需要过量表达甘油代谢途径中的第一步中的相关酶即甘油脱氢酶基因(gldA)以提高丙酸杆菌对甘油的利用率，最终达到提高丙酸的产量的目的。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种高产丙酸詹氏丙酸杆菌工程菌，是以詹氏丙酸杆菌(Propionibacteriumjensenii)为宿主，过量表达来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia subsp.pneumoniae ATCC 12657)的苹果酸脱氧酶基因 mdh,或者同时还过量表达来自肺炎克雷伯氏菌的甘油脱氢酶基因gldA。
[0006]所述詹氏丙酸杆菌优选詹氏丙酸杆菌JN926 CCTCC No:M 2013071。
[0007]所述甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶的氨基酸序列分别如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2所
/Jn ο
[0008]所述甘油脱氢酶基因和苹果酸脱氢酶基因通过表达载体pZGX04进行表达。
[0009]所述表达载体pZGX04的构建方法参见文献Zhuge，X.，Liu L.，Shinj H.D.，Chen, R.R.，Li，J.，DujG.，Chen, J.，2013.Development of a Propionibacterium-Escherichiaco I i shuttle vector as a useful tool for metabolic engineering ofPropionibacterium jensenii, an efficient producer of propionic acid.Appl.Environ.Microbiol.79，4595-4602。
[0010]本发明还提供构建所述工程菌的方法，是将来源于肺炎克雷伯氏菌的苹果酸脱氢酶基因mdh单独过量表达于詹氏丙酸杆菌中，或将mdh与编码甘油脱氢酶的gldA基因共表达于詹氏丙酸杆菌中，以提高甘油的利用率，从而提高甘油代谢途径通量，并最终导致丙酸生产强度以及产量的提高。
[0011]所述方法优选以下步骤:以肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonia subsp.pneumoniae ATCC 12657全基因组序列为模板，PCR扩增得到或采用化学全合成的方法获得mdh目的片段。通过平末端连接将其克隆入质粒pZGX04 (Zhuge et al., 2013),得到mdh基因表达质粒pZGX04-mdh。构建好的重组质粒pZGX04-mdh经DNA测序证明，表明重组质粒构建正确。将重组质粒用电击转化的方法，转入受体菌Propionibacterium jensenii,在SLB培养基上进行随即挑选，利用菌落PCR的方法进行筛选，得到苹果酸脱氢酶过量表达的重组菌。
[0012]所述方法还优选以下步骤:以肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonia subsp.pneumoniae ATCC 12657全基因组序列为模板，PCR扩增得到或采用化学全合成的方法获得gldA和mdh目的片段。通过平末端连接将其克隆入质粒pZGX04 (Zhuge et al.，2013)，得到gldA和mdh基因表达质粒pZGX04-gldA_mdh。构建好的重组质粒pZGX04-gldA_mdh经DNA测序证明，表明重组质粒构建正确。将重组质粒用电击转化的方法，转入受体菌Propionibacterium jensenii,在SLB培养基上进行随即挑选,利用菌落PCR的方法进行筛选，得到甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶过量表达的重组菌。
[0013]本发明还提供了一种提高詹氏丙酸杆菌产丙酸的方法，采用上述詹氏丙酸杆菌工程菌为出发菌株，将在32°C厌氧瓶中静置培养48h的种子以10%的接种量转入装有发酵培养基的发酵罐中，于32°C、200rpm条件下培养，在60_132h之间以3.33mL/h恒速流加浓度为300g/L的甘油溶液，间歇通氮气。
[0014]种子培养基(g/L):乳酸钠IOg,酵母粉IOg,胰蛋白胨大豆肉汤(Trypticase soybroth)10g, pH7.0。
[0015]发酵培养基(g/L):酵母粉10g，胰蛋白胨大豆肉汤5g，K2HPO4 2.5g，KH2PO4 1.5g,甘油 30g, CoCl2 8mg, ZnSO4 8mg, MgSO4 8mg, pH7.0。
[0016]本发明的有益效果:本发明的特点是以詹氏丙酸杆菌为出发菌株，利用分子手段构建了一株过量表达苹果酸脱氢酶的重组菌和一株过量表达甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶的重组菌，通过增大甘油代谢通量导致丙酸产量的提高。过量表达苹果酸脱氢酶的基因工程菌的生产强度和产量分别比出发菌株提高了 33.9%和33.9%，分批补料发酵丙酸产量由原来的26.95g/L提高到36.09g/L。过量表达甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶的基因工程菌的生产强度和产量分别比出发菌株提高了 46.6 %和46.3 %，分批补料发酵丙酸产量由原来的26.95g/L提高到39.43g/L。这为工业生物技术改造詹氏丙酸杆菌以及提高丙酸发酵生产能力提供了新的思路。
[0017]生物材料保藏
[0018] 詹氏丙酸杆菌(Propionibacteriumjensenii) JN926,于 2013 年 3 月 6 日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2013071。【具体实施方式】
[0019]细胞干重(DCW)的测定:取一定量的菌悬液，用稀盐酸溶液适当稀释后用UV 7500型可见分光光度计，于600nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
[0020]丙酸的测定方法:高效液相色谱(HPLC)
[0021]仪器:Agilentl200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)
[0022]色谱条件:色谱柱:AgilentZORBAX SB-Aq 柱,5 μ m, 4.6mmX 250mm ；流动相:0.138mol/L NaHP04,1 % (v/v)乙腈,用磷酸调至 pH2.0 ;流速:0.8mL/min ;柱温:35°C;进样量:10 μ L ;紫外检测器波长:210nm。
[0023]样品制备:1.5mL发酵液在8000rpm下离心5min，取上清液移入IOmL容量瓶中，用
3.68mm/L硫酸溶液定容至IOmL,经0.22 μ m滤膜过滤后,滤液供液相分析用。
[0024]甘油脱氢酶酶活的测定方法:
[0025]3mL 发酵液在 1000rpm 下离心 5min，用 0.5mL K2HPO4-KH2PO4 缓冲液(50mM，ρΗ7.0)洗一次，然后用相同体积的缓冲液重悬。超声波破碎细胞后1000rpm，4°C离心15min，取
0.2mL上清，30mM硫酸铵，0.2M甘油，1.2mM NAD混合于3mL反应池后，在340nm，30°C下测定
每分钟吸光值的变化值。利用下面的公式计算得到发酵液酶活:
[0026]
【权利要求】
1.一种高产丙酸的詹氏丙酸杆菌工程菌，其特征是，过量表达来自肺炎克雷伯氏菌的苹果酸脱氢酶基因mdh。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，同时还共表达了来自肺炎克雷伯氏菌的甘油脱氢酶基因gldA。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征是，苹果酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.根据权利要求2所述的工程菌，其特征是，甘油脱氢酶的氨基酸序列如SEQID N0.1所示。
5.根据权利要求1或2所述的工程菌,其特征是，以詹氏丙酸杆菌(Propionibacteriumjensenii) JN926 CCTCC N0:M 2013071 为宿主。
6.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征是，以质粒PZGX04为表达载体。
7.—种构建权利要求1或2所述工程菌的方法，其特征是，将目的基因片段通过平末端连接克隆入质粒PZGX04，构建好的重组质粒转入詹氏丙酸杆菌，经筛选验证得到相应基因过量表达的重组菌。
8.一种应用权利要求1或2所述工程菌生产丙酸的方法，其特征是，将在32°C厌氧瓶中静置培养48h的种子转入装有发酵培养基的发酵罐中，于32°C、200rpm条件下培养，在60-132h之间以3.33mL/h恒速流加浓度为300g/L的甘油溶液，间歇通氮气。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子的培养所用种子培养基组成为:乳酸钠10g，酵母粉10g，胰蛋白胨大豆肉汤10g，pH7.0，溶于IL水中。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为:酵母粉10g，胰蛋白胨大都肉汤 5g, K2HPO4 2.5g，KH2PO4 1.5g,甘油 30g，CoCl2 8mg，ZnSO4 8mg，MgSO4 8mg，pH7.0， 溶于IL水中。
【文档编号】C12P7/52GK104004700SQ201410271329
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】陈坚, 堵国成, 刘龙, 诸葛鑫 申请人:江南大学