痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用
【专利说明】痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用
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技术领域
[0002]本发明属于生物酶法制备共轭亚油酸的技术领域，涉及利用脂肪酶和亚油酸异构酶联合催化制备共轭亚油酸的方法及反应体系。
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【背景技术】
[0004]共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid, CLA)是由必需脂肪酸亚油酸(Linoleic Acid, LA)衍生的一系列含有共轭双键的十八碳二稀酸(octadecadienoicacid)的异构体的总称。其中，cis-9, trans-11 CLA和trans-10，cis-12 CLA被认为是主要的生物活性单体，具有多种生理活性，如抗癌症、抗动脉粥样硬化、降血脂、减肥、促进生长等，在医药、食品、保健品和化妆品等行业中具有广阔的应用前景。
[0005]天然CLA主要存在于反刍动物的肉和乳中，相对于专家建议每日需要的CLA食入量，以食用动物的肉和乳作为CLA的摄取方式是远远不够的，因此对CLA合成转化的研宄越来越得到广泛的关注。化学合成方法制得的产物往往包含一些活性功能尚不明确的异构体，而亚油酸异构酶(Conjugated linoleic acid isomerase)可特异性地催化亚油酸(LA)转化为活性CLA异构体，并且反应条件温和，目前已得到众多国内外研宄者的关注。来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶teria? acnes isomerase,PAI)是为数不多的可以将亚油酸转化生成tlO, cl2 CLA的几种亚油酸异构酶之一，并且其蛋白晶体结构已经得到解析。对其的酶学性质研宄发现其最适反应条件温和且具有较好的反应活性，适合工业化应用。故本研宄选用PAI作为联合催化反应体系中的关键酶之一。
[0006]然而，游离亚油酸在自然界中很少存在，大多数是通过化学合成所得，因此价格较贵而且不利于扩大转化生产。大豆油中的亚油酸含量很丰富，是亚油酸的经济来源之一，其总脂肪酸中约54%是亚油酸(主要以甘油三酸酯的形式存在)。根据对亚油酸异构酶的底物特异性及蛋白晶体结构分析发现其只能利用游离的亚油酸来异构化产生CLA，而不能利用亚油酸的甘油三酯形式，但这种形式的亚油酸是豆油中亚油酸的主要存在形式。
[0007]脂肪酶属于水解酶类(hydrolase)，能水解大豆油中的甘油三酯成分释放出游离的脂肪酸，其中亚油酸成分可以作为亚油酸异构酶的特异性底物来催化生成共轭亚油酸。米根霉脂肪酶oryzae lipase，R0L)是作为一种典型的脂肪酶，目前已得到了广泛的研宄，对其的催化水解甘油三酯的能力也得到了众多研宄学者的肯定，并且ROL的反应条件温和，对碳链长度为C8-C18的脂肪酸表现出偏爱性，故本实验采用ROL作为联合催化反应体系的另一种关键酶。
[0008]大豆油对亚油酸异构酶转化生成CLA来说不是一种合适的底物，但在脂肪酶的协助下，大豆油中以甘油三酯形式存在的亚油酸对亚油酸异构酶来说变得可利用，这为联合催化反应体系的建立提供了理论基础。
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【发明内容】
[0010]解决的技术问题:本发明的目的是提供亚油酸异构酶PAI的一种表达载体及重组菌；本发明的另一目的是提供一种制备共轭亚油酸的联合催化方法包括其催化工艺条件和ROL和PAI两种酶的最适添加量，使其能够经济高效地从天然植物油料大豆油直接催化制备共轭亚油酸。
[0011]技术方案:痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所述。
[0012]编码上述痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的基因，该基因的核苷酸序列pail如SEQ IDN0.2所述。
[0013]包含所述核苷酸序列的重组质粒pET20b-/7ai/。
[0014]包含所述核苷酸序列的重组质粒pET20b_/7aiJ的制备方法，其特征在于构建步骤为:将经序列优化获得的基因/7aiTiPpET20b用内切酶Nde m xho J酶切，连接构建重组质粒 pET20b-/7ai/，获得重组质粒 pET20b-/7ai/。
[0015]含有所述重组质粒pET20b-/7aiJ的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0016]痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的纯化方法，挑取含重组质粒pET20b-/7aiJ的大肠杆菌摇菌培养；当培养至OD6tltl达到0.6-0.8，用终浓度0.5 mM IPTG诱导6_8 h ;离心收集菌体并洗涤；用镲离子亲和柱纯化:向洗涤后的菌体中加入IXBinding Buffer重悬菌体，超声破碎菌液后离心，然后取离心液上样，再用IXBinding Buffer洗柱子除去未结合的蛋白质，最后用含有400 mM咪唑的洗脱液洗脱，即得目标蛋白。
[0017]所述痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶在协同催化制备共轭亚油酸中的应用。
[0018]具体应用方法为:以植物油为原料，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶和米根霉脂肪酶进行联合协同催化。其中，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶为天然酶或重组酶的游离形式或固定化形式，米根霉脂肪酶为天然酶或重组酶的游离形式或固定化形式。
[0019]工艺条件为:将适量的植物油于冰水浴下进行超声波乳化分散，获得浓度为40%(w/v，g/mL)植物油乳化液；在pH 7.0、35°C的条件下，植物油终浓度为20%，加入分别为1.575 U/g植物油的重组ROL和1395 U/g植物油的重组PAI，复合酶协同催化反应36 h，共轭亚油酸转化率可达80%以上。
[0020]所述的重组米根霉脂肪酶ROL (GenBank N0.AF229435)，氨基酸序列如SEQ IDN0.5所述，由常规克隆获得ROL的全基因序列，按照实施例4所述即可获得ROL重组酶液。
[0021]有益效果:与现有技术相比，本发明具有如下优点:
(I)采用复合酶协同催化，可以由含较高亚油酸的植物油直接制得共轭亚油酸，克服了亚油酸异构酶必须以昂贵的游离亚油酸为底物生产共轭亚油酸的缺点，大量地节省了成本。
[0022](2)利用重组菌制备复合酶，提高酶活，增加酶产量，不需要购买商业酶，有效节约成本。
[0023](3)异构化产物共轭亚油酸成分单一，具有多种生理活性。
[0024](4)本方案具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益，有很好的工业化前景。
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【附图说明】
[0026]图1是最适反应条件下，复合酶催化大豆油的反应时间曲线。
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【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例进一步阐明本发明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
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实施例1:PAI基因的设计及合成:
根据密码子使用频率数据库信息Codon Usage Database将编码亚油酸共轭酶基因PAI按大肠杆菌偏好密码子优化。在不改变氨基酸序列的前提下，采用JCat密码子优化软件选择最优密码子，同时参考mRNA的二级结构进行微调使之活化能尽可能高，使mRNA更易于表达。密码子优化后的Pai基因交由上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成。
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实施例2:重组PAI的克隆:
引物:上游引物 Pl:5’ -cgccatatgtctatctccaaagacagccg-3’(含 Ndel 酶切位点)下游引物 P2:5’ -ccgcicga^acgaagaagcgggtaacd’(含 XhoR 酶切位点
[0031]PCR反应体系:1 yL合成序列，I yL上游引物Pl，lyL下游引物P2，25 yLPremix ExTaq,22 μ L ddH20o
[0032]PCR反应条件:94°C变性 10 min ;94°C变性30 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸 1.5min，30 Cycles ;72°C延伸 10 min ;4°C保温。
[0033]PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(B10MIGA，上海)。
[0034]将纯化的PCR扩增产物经1、通o7I双酶切后，与同样双酶切的表达质粒pET-20b连接，热击转化至E.coli ToplO感受态细胞中。在Amp抗生素(100 μ g/mL)的LLB平板中挑选单菌落，扩增培养，提取质粒，双酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定进而构建出重组表达质粒pET-20b-pai。
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实施例3:重组PAI的诱导表