达及纯化:
将经鉴定的阳性重组质粒pET-20b-pai转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，在含有Amp抗生素(100 μ g/mL)的LLB平板上筛选出阳性克隆。将阳性克隆转接到新鲜的5mL的LLB液体培养基中，370C，180 rpm条件下培养至OD6tltl 0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25°C，120 rpm过夜诱导培养。将诱导表达的菌液于4°C ,8000 rpm离心5 min,用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤细胞两次，最后用6 mL此缓冲液重悬菌体并于冰浴中超声波破碎菌体，4°C、12000 rpm离心20 min，得到上清粗酶液。上清粗酶液经AKTA蛋白纯化仪通过亲和Ni2+柱进行线性梯度洗脱纯化，收集目标蛋白PAI。
[0036]
实施例4:重组ROL的诱导表达。
[0037]将成功克隆有ROL基因的重组质粒pPICZa A-ROL经限制性酶Sac I进行单酶切，使质粒线性化后电击转入毕赤酵母KM71H (购自Invitrogen公司)感受态细胞中。采用橄榄油-MMH-RB活性平板及三辛酸甘油酯平板来筛选产脂肪酶活力较高的重组菌，挑选橄榄油-MMH-RB活性平板中荧光圈大的和三辛酸甘油酯平板中水解圈大的菌落作为重组毕赤酵母工程菌。按Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册上的操作进行诱导表达，获得R0L，无需纯化，直接使用。
[0038]
实施例5:重组亚油酸异构酶PAI和米根霉脂肪酶ROL酶活的测定:
亚油酸异构酶酶活测定方法:在1.65 cmX12.5 cm螺帽试管中，依次加入4.75 mLNa2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH 7.0),0.2 mL重组PAI酶液、50 μ L亚油酸乳化液，35°C、180rpm振荡反应I h后，从中取200 μ L加入30 μ L 10%三氯乙酸终止反应，再加入I mL正己烷振荡萃取10 min，离心破除振荡时形成的乳化层，取上层正己烷部分，经适当稀释后测定234 nm处的吸光值。由测得的吸光值根据CLA标准曲线确定生成CLA的量。定义每分钟生成I μ g的CLA所需酶量为I个酶活单位(U)。
[0039]脂肪酶酶活测定方法:以pNPP (p-nitrophenyl palmitate)为底物的分光光度法测定脂肪酶酶活，以 13.5 mmol/L 的 p-NPC 为底物，850 μ L 0.05 mol/L Tris-HCL pH 7.0缓冲液与100 μ L酶液，35°C恒温水浴摇床保温5 min,加入50 μ L底物溶液，35°C恒温水浴摇床准确反应5 min，于冰上终止反应。取上清于410 nm处测定吸光值。将对硝基苯酚稀释成适当浓度做标准曲线。酶活力单位定义为:在pH 7.0、35°C条件下，每min水解底物释放I ymol对硝基苯酚所需要的酶量为I个脂肪酶活力单位。
[0040]
实施例6:复合酶联合协同催化体系中植物油脂的抽提和检测:
反应结束后，往反应混合物中加正己烷振荡萃取产物中的脂肪酸，冷冻离心(10，000g，15 min，4°C)破除振荡萃取形成的乳化层，然后收集上层正己烷液体，再用无水硫酸钠去多余水分或水溶性物质，用旋转蒸发仪在40°C下蒸发脱除溶剂正己烷，将浓缩所得的脂肪酸转移至洗净备用的试样容器中。然后通过两步法进行油脂的甲酯化:加入含1%甲醇钠的甲醇溶液，50°C加热15min，使脂肪酸成游离状，加入50 mL盐酸甲醇溶液80°C加热60 min进行游离脂肪酸甲醋化，然后旋转蒸发去除甲醇，离心得到脂肪酸甲酯。
[0041]制备得到的脂肪酸甲酯的检测分析则是通过配备有FID检测器和DB-WAXETR (30m*0.25 mm, Φ 0.25微米，安捷伦，美国)毛细管柱的安捷伦-7890A气相色谱仪:在实验中选择氮气用作载体气体，通气量为2 mL/min，进样口温度设置为240°C，分流比为15:1，温度梯度设定为120°C保温3min，120~190°C升温速度保持在5°C /min, 190~210°C升温速度保持l°C/min，最后当温度达到210°C继续保温3 min。亚油酸和tlO，cl2共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的鉴定是通过与其的标准品进行比较而得到的。通过用峰面积归一化法计算共轭亚油酸甲酯百分率。
[0042]
实施例7:联合协同催化大豆油制备共轭亚油酸:
将含有400 g/L大豆油的乳化体系于冰水浴下进行超声波乳化分散，获得浓度为40%(w/v, g/mL)大豆油乳化液。
[0043]在pH 7.0,35°C的条件下，大豆油终浓度为20%，重组ROL和PAI的加入量分别为1.57 U/g大豆油、1395 U/g大豆油，复合酶协同催化反应36 h，共轭亚油酸转化率可达
86.Tl。
[0044]
实施例8:联合协同催化葵花籽油制备共轭亚油酸:
将含有400 g/L葵花籽油的乳化体系于冰水浴下进行超声波乳化分散，获得浓度为40% (w/v，g/mL)葵花籽油乳化液。
[0045]在pH 7.0、35°C的条件下，葵花籽油终浓度为20%，重组ROL和PAI的加入量分别为1.42 U/g葵花籽油、1422 U/g葵花籽油，复合酶协同催化反应36 h，共轭亚油酸转化率可达89.3%ο
[0046]
实施例9:联合协同催化玉米油制备共轭亚油酸:
将含有400 g/L玉米油的乳化体系于冰水浴下进行超声波乳化分散，获得浓度为40%(w/v, g/mL)玉米油乳化液。
[0047]在pH 7.0,35°C的条件下，玉米油终浓度为20%，重组ROL和PAI的加入量分别为1.35 U/g玉米油、1504 U/g玉米油，复合酶协同催化反应36 h，共轭亚油酸转化率可达
87.6%。
【主权项】
1.痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶，其特征在于氨基酸序列如SEQID N0.1所述。
2.编码权利要求1所述痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列pail如SEQ ID N0.2所述。
3.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒pET20b-/7ai/。
4.包含权利要求3所述核苷酸序列的重组质粒pET20b-/7aiJ的制备方法，其特征在于构建步骤为:将经序列优化获得的基因/7aiTiPpET20b用内切酶Nde m xho J酶切，连接构建重组质粒pET20b-/7ai/，获得重组质粒pET20b-/7ai/。
5.含有权利要求4所述重组质粒pET20b-paiJ的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
6.痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的纯化方法，其特征在于挑取含重组质粒pET20b-pail的大肠杆菌摇菌培养；当培养至OD6tltl达到0.6-0.8，用终浓度0.5 mM IPTG诱导6_8 h ;离心收集菌体并洗涤；用镲离子亲和柱纯化:向洗涤后的菌体中加入IXBinding Buffer重悬菌体，超声破碎菌液后离心，然后取离心液上样，再用IXBinding Buffer洗柱子除去未结合的蛋白质，最后用含有400 mM咪唑的洗脱液洗脱，即得目标蛋白。
7.权利要求1所述痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶在协同催化制备共轭亚油酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于以植物油为原料，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶和米根霉脂肪酶进行联合协同催化；其中，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶为天然酶或重组酶的游离形式或固定化形式，米根霉脂肪酶为天然酶或重组酶的游离形式或固定化形式。
【专利摘要】痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。本发明采用复合酶协同催化，可以由含较高亚油酸的植物油直接制得共轭亚油酸，克服了亚油酸异构酶必须以昂贵的游离亚油酸为底物生产共轭亚油酸的缺点，大量地节省了成本。利用重组菌制备复合酶，提高酶活，增加酶产量，不需要购买商业酶，有效节约成本。异构化产物共轭亚油酸成分单一，具有多种生理活性。本方案具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益，有很好的工业化前景。
【IPC分类】C12N15-70, C12N1-21, C12N9-90, C12R1-19, C12N15-61, C12P7-64
【公开号】CN104531655
【申请号】CN201410728551
【发明人】李迅, 顾华祥, 王飞
【申请人】南京林业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月4日