一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种利用微生物液态发酵法生产假丝酵 母蛋白酶制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，蛋白酶广泛应用于洗涤剂、饲料、食品工业、 酿酒酿造、制革工业以及医药领域中；除此之外，蛋白酶还是用途最广泛的酶制剂之一，应 用于洗涤剂、制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、酱油、纺织、医药品、化妆品等的生产和生物材 料的提取上。蛋白酶的广泛应用，不仅简化了行业的生产工艺、节约成本、提高产品得率，而 且对改善环境，减少二氧化碳排放也做出了积极贡献。近年来随着人们环保意识的增强，创 建资源节约型、环境友好型社会的观念日益深入人心，为进一步推广蛋白酶的生产与应用 创造了有利条件。
[0003]目前市场上蛋白酶品种虽然多，但是所用生产菌株的种类较少，仅限于传统上食 品加工用的微生物和确认无害的菌株；另外，采用现有的生产蛋白酶的菌株的蛋白酶的产 量不大，且生产的蛋白酶的酶活不高。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明实施例提供一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法，主要目的 是开发新的制备蛋白酶制剂的菌种，制备出酶活较高的假丝酵母蛋白酶制剂，同时提高蛋 白酶制剂的产量。
[0005] 为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
[0006] 一方面，本发明实施例提供了一种假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，该方法包括 如下步骤：
[0007] 将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌发酵液；
[0008] 对所述星形假丝酵母菌发酵液进行盐析处理，得到假丝酵母蛋白酶；
[0009] 将所述假丝酵母蛋白酶溶解于缓冲溶液后，进行透析、提纯处理，得到假丝酵母蛋 白酶液；
[0010] 将所述假丝酵母蛋白酶液超滤浓缩后，得到浓缩蛋白酶液；
[0011] 向所述浓缩蛋白酶液加入无机盐、载体辅料，充分混合后得到混合物；
[0012] 对所述混合物进行冷冻、干燥处理，得到假丝酵母蛋白酶制剂。
[0013] 前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌 发酵液的步骤，包括：
[0014] 对星形假丝酵母菌进行菌株诱变处理，得到诱变菌株；
[0015] 从所述诱变菌株中筛选出产酶菌株；其中，所述产酶菌株为能够产生蛋白酶的星 形假丝酵母菌菌株；
[0016] 将所述产酶菌株活化后，接种于种子培养基，在28-37°C下培养18-24小时后，得 到种子液；
[0017] 将所述种子液以3-5%的接种量接种于第一发酵容器中，在28-37°C的温度及 150-200转/分钟的搅拌速度下，使所述第一发酵容器中的种子液发酵18-24小时，得到第 一发酵液；
[0018] 将所述第一发酵液以3-5%的接种量接种于第二发酵容器中，在35-42°C的温度、 150-200转/分钟的搅拌速度及0. 1-0. 3m3/h的通风量的条件下，使所述第二发酵容器中的 第一发酵液发酵48-72小时，得到星形假丝酵母菌发酵液。
[0019] 前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，采用硫酸铵对所述星形假丝酵母菌发酵 液进行盐析处理。
[0020] 前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，所述缓冲溶液为pH值为5-7的乙酸-乙 酸钠溶液。
[0021] 前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，对所述假丝酵母蛋白酶液进行超滤浓 缩，得到浓缩蛋白酶液的步骤，具体为：
[0022] 用截留分子量为8000_15000Da的超滤膜对所述假丝酵母蛋白酶液进行超滤、浓 缩，得到浓缩蛋白酶液；
[0023] 其中，所述假丝酵母蛋白酶液与所述浓缩蛋白酶液的体积比为6-10:1。
[0024] 前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，向所述浓缩蛋白酶液加入无机盐、载体 辅料，充分混合后得到混合物的步骤具体为：
[0025] 向所述浓缩蛋白酶液加入无机盐，搅拌均匀使无机盐充分溶解，得到第一混合 物；
[0026] 向所述第一混合物中加入载体辅料，充分揉和，得到混合物。
[0027] 前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，所述第一混合物中所述无机盐的浓度为 0. 5-1% ；
[0028] 所述载体辅料的添加量与第一混合物的重量比为0.8-1. 2:1。
[0029] 前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，所述载体辅料为玉米粉、米淀粉和豆饼 粉中的任一种或几种的混合物。
[0030] 前述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，对所述混合物进行冷冻、干燥处理，得到 假丝酵母蛋白酶制剂的步骤，包括：
[0031] 将所述混合物在真空度为30-50Pa、温度为-18 --22°C的条件下冷冻8_10小时， 再将所述混合物在真空度为30-50Pa、温度为-30--36°C的条件下冷冻15-18小时后，将冷 冻后的混合物粉碎、挤压、切割，得到假丝酵母蛋白酶颗粒；
[0032] 将所述假丝酵母蛋白酶颗粒置于40-60°C下进行干燥处理后，在其表面涂覆氢化 牛油后继续干燥处理，得到假丝酵母蛋白酶制剂。
[0033] 另一方面，本发明实施例还提供一种假丝酵母蛋白酶制剂，所述假丝酵母蛋白酶 制剂由上述任一项所述的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法制备而成。
[0034] 本发明实施例提出的一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法，至少具有如下优 占.
[0035] 本发明实施例采用新的菌种假丝酵母制备出酶制剂，即假丝酵母蛋白酶制剂，所 用的假丝酵母菌种为新开发菌种，符合FAO/WHO食品添加剂专家委员会JECFA的评估标准。 所用的假丝酵母菌种经诱变选育产酶能力较高，制得假丝酵母蛋白酶制剂具有较高的酶活 力，酸性蛋白酶活力彡2125U/g干基，活力回收率到达51. 6%。
[0036] 进一步地，本发明实施例制备的假丝酵母蛋白酶制剂以玉米粉、米淀粉和豆饼粉 中的一种或几种为主要辅料，生产成本低；假丝酵母蛋白酶制剂在制备过程采用离心、超 滤、盐析、透析、冷冻干燥等步骤，产品杂质含量低，符合食品添加剂标准的要求。
[0037] 进一步地，本发明实施例在制备假丝酵母蛋白酶制剂的过程中无三废（废水、废 渣、废气）排出，减少了能耗、运行成本较低，清洁生产，具有较大的环境优势。且本发明提 供的假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法适用于工业化大批量生产酸性蛋白酶制剂。
【具体实施方式】
[0038] 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合 较佳实施例，对依据本发明提出的一种假丝酵母蛋白酶制剂及其制备方法其具体实施方 式、特征及其功效，详细说明如下。
[0039] 在葡萄酒酿造初期，若添加星形假丝酵母菌，不仅利于葡萄酒的澄清，还能增加酒 体的稳定性；本发明的发明人发现这是因为星形假丝酵母菌能产生蛋白酶，蛋白酶葡萄酒 酿造初期的蛋白质及含氮化合物水解掉，使其生成可溶性肽及氨基酸。基于此，本发明的发 明人提出一种假丝酵母蛋白酶制剂及利用微生物液态发酵法生产假丝酵母蛋白酶制剂的 方法，从而开发了新产酶菌株，且所制备的酶制剂具有较高且稳定的酸性酶活力，适用于食 品工业。
[0040] 具体地，本发明实施例提出的一种假丝酵母蛋白酶制剂的制备方法，包括如下步 骤：
[0041] 1)将星形假丝酵母菌制成星形假丝酵母菌发酵液。该步骤具体包括：
[0042] 11)对星形假丝酵母进行菌株诱变处理，得到诱变菌株。
[0043] 具体地，从培养假丝酵母菌体的固体平板上挑取星形假丝酵母（Candida stellata)的单菌落，将挑选出的星形假丝酵母的单菌落接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养 基上（具体地，将星形假丝酵母的单菌落接种于装有20-30毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培养 基的250毫升的三角瓶中），在25-37°C的温度下于100-300转/分钟的摇床上培养24-48 小时，得到发酵液。将发酵液放置在离心机中，在2000-8000转/分钟的转速下，离心3-10 分钟，弃去上清液，用无菌水悬浮下层菌落（细胞），得到菌液，且菌液中的细胞浓度为 1X108-8X108个/毫升。吸取1-3毫升菌液放置于4°C冰箱中作为对照；从剩余的菌液中 吸取4-6毫升（优选5毫升）加入无菌平板中，lX105-5X105J/mm2的计量处理无菌平板 (在此，J/mm2是能量密度单位，表示单位面积吸收的能量；表示无菌平板中的菌液，每1mm2 吸收紫外线能量为1X105-5X105J)。将磁力搅拌器置于紫外灯下照射30分钟后，再将无 菌平板置于磁力搅拌器上，无菌平板等距放置，且距紫外灯30-40厘米处，照射10-30分钟 后，得到第一诱变菌株。
[0044] 将第一诱变菌株放入微波源为2450MHz、850W的微波炉中，每照射10秒，冷却10 秒后再照射10秒，重复多次，冷却后，在28-37°C下培养24-72小时，得到诱变菌株。
[0045] 该步骤中，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的配方为（g/L):蛋白