一种茄镰刀菌漆酶及其克隆和重组表达方法
【专利摘要】本发明公开了一种从茄镰刀菌的菌株上所获得的茄镰刀菌漆酶，其相关蛋白基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，该茄镰刀菌漆酶对应的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明所公开的漆酶在毕赤酵母中的重组表达比活力高，并且具有优良的热耐受性与碱耐受性，能够满足造纸，漂白以及饲料生产等应用的要求。
【专利说明】一种茄镰刀菌漆酶及其克隆和重组表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的从茄镰刀菌上克隆的茄镰刀菌漆酶的基因序列和表达蛋白，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]在造纸，纸浆，漂白以及饲料生产中，为了降低化学品导致的污染，生物酶制剂的应用越来越广泛，在这之中漆酶的使用非常普遍，漆酶是一种结合多个铜原子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶。漆酶作用底物相当广泛，能够对多种污染物如各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚、芳香胺等。漆酶是近年发现在造纸工业中最具潜力的生物酶，具有催化氧化木素的能力。漆酶能选择性地催化木质素降解，不会产生有毒物质，并且生产在常温、常压的温和条件下进行，节约设备和能耗。因此漆酶在造纸工业废水处理等方面有着非常巨大的应用前景，但是已有的漆酶普遍存在比活力低，耐热性，碱耐受性差等问题。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的缺陷， 申请人:多年来尝试筛选从菌株中寻找不同的蛋白酶以期获得良好的降解木质素的能力，在大量筛选中 申请人:从一种爺镰刀菌(Fusarium solanistrain)中克隆其核苷酸序列进行了克隆得到了一个完整的漆酶基因序列，基于该序列表达的漆酶具有高比活力，强的热耐受性，碱耐受性等特点。
[0004]基于上述发现， 申请人:完成了本发明。本发明的技术方案是如下实现的:
[0005]本发明首先公开了一种茄镰刀菌漆酶，其相关蛋白基因的核苷酸序列及其氨基酸序列分别如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2所示。
[0006]上述茄镰刀菌漆酶既可以通过人工合成相关基因序列得到(例如华大基因或其它生物基因合成单位均提供相关商业服务)，也可以通过克隆茄镰刀菌来获得，该漆酶基因的克隆方法具体包括下述步骤:
[0007]I)以木质素为唯一碳源培养茄镰刀菌菌株，然后回收菌体，提取其总RNA并反转录得到cDNA ；
[0008]2)对所得cDNA进行扩增得到茄镰刀菌菌株的漆酶基因部分序列进行测序。
[0009]在上述克隆方法中，所采用的克隆引物对如下所示:
[0010]Lac-FICAAGGGAACGACCATGCAYTDBCAYGG ；
[0011 ] Fus-RlCCACTTCGAAGTGCCAATCTANRTGRCARTGdIA。
[0012]在上述引物序列中，Y、R、B、D等代表兼并碱基，其所对应的可替换碱基序列采用本领域通用规则，即 R = A/G, Y = C/T, M = A/C, K = G/T, S = C/G, W = A/T, H = A/C/T, B=C/G/T，V = A/C/G，D = A/G/T, N = A/C/G/T ;其中的dl代表脱氧次黄嘌呤，从其功能上而言相当于N，扩增效果更好。
[0013]克隆测序后发现的新漆酶基因使用5’ RACE与3’ RACE得到其完整mRNA序列，该漆酶命名为lcc4。
[0014]最后， 申请人:深入研究了上述漆酶的重组表达方法，发现采用毕赤酵母作为载体具有较为理想的表达效力，具体的包括下述步骤:
[0015]I)使用Eco R1、Not I限制两端带有酶切位点的镰刀菌漆酶基因以及pPIC9K，胶回收产物，T4连接酶连接，转化到E.coli ToplO，鉴定转化子，取阳性克隆进行测序；
[0016]2)将质粒DNA(克隆至pPIC9K的重组子)，用Sac I线性化质粒，沉淀并回收DNA ；
[0017]3)取毕赤酵母感受态细胞和线性化的质粒DNA混合均匀后电转化，电转化器完成后加入预冷的山梨醇溶液，将液体涂布MD平板，培养至白色的菌落长出；
[0018]4)影印转化子至含有抗生素的YEro平板培养，挑取长势良好的菌落到普通YEro平板上培养将其接种至BMGY液体培养基；5)培养后离心收集菌体，用BMMY液体培养基重悬菌体，将菌液放入另一无菌摇瓶中继续培养并加入甲醇维持诱导。
[0019]在上述诱导完成后，离心取上清进行SDS-PAGE检测即可。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明漆酶在毕赤酵母中的重组表达过程示意图。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
[0022]爺镰刀菌Fusarium solani strain,以木质素为唯一碳源进行培养,28°C震荡培养5天然后回收菌体，提取其总RNA，使用oligo (dT) 18反转录得到cDNA，使用说明书公开的引物扩增(常规PCR条件即可)得到漆酶基因部分序列测序，随后使用，5’RACE与3’RACE得到了漆酶基因的完整mRNA序列。在NCBI数据库进行分析与比对，发现这个漆酶基因尚未被公开过，命名为lcc4。
[0023]根据 申请人:的研究，在序列表所示序列中，碱基序列的预测信号肽部分为ATGTACAAGACTCTATATTCACTCCTGCCTCTCGTCTTTGCTACCTCTATCAGCACC，对应的氨基酸序列中预测信号肽为 MYKTLYSLLPLVFATSIST。
[0024]实施例2
[0025]以下述方法测试漆酶的耐热性:
[0026]在40_70°C下以10°C为级差测试上述漆酶的耐热性，测试时间为60min，在5、10、20、30、6011^11这几个时间点测试漆酶对48了5(2，2’氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸_6)铵盐)的氧化。上述漆酶经过酶活测定显示，最适温度为25~45°C。
[0027]以同样类似的方法测试漆酶对pH的适应性，漆酶酶活力测定方法采用愈创木酚法，酶活单位定义为在25°C条件下每分钟使I μ mol的底物转化所需的酶量。经试验发现，漆酶的最适PH= 3.5-6.5。
[0028]实验结果显示，在上述温度和pH范围内，漆酶酶活保持在80 %以上，适于工业应用。
[0029]实施例3
[0030]以漆酶lcc4为例，说明本发明漆酶在毕赤酵母中的重组表达过程:
[0031]采用Eco RI&Not I限制两端带有酶切位点的lcc4基因以及pPIC9K，胶回收产物，T4连接酶连接，转化E.coli ToplO，次日鉴定转化子，取阳性克隆测序。测序正确者用于下游实验。
[0032]准备8ug的质粒DNA (克隆至pPIC9K的重组子)，用Sac I线性化质粒，乙醇沉淀，回收DNA待用。
[0033]取80ul P.pastoris GSl 15感受态细胞和5ug线性化的质粒DNA混合，混合均匀后，加入至电转杯中，1500V电转后,马上加入1ml预冷的sorbital,将液体取出后放入至一新管中，30°C温浴半小时，每300ul涂布于一个MD平板，30°C倒置培养至白色的菌落长出。
[0034]影印转化子至含有3mg/ml G418的YEH)平板上，30°C倒置培养2天左右，挑取那些在3mg/ml G418的YETO长得很好的菌落到普通的YETO平板上，30°C培养两天，再将其接种至30ml的BMGY液体培养基，纱布缠好瓶口，30°C，220rpm培养30小时，离心收集菌体，用15mlBMMY液体培养基重悬菌体，将菌液放入另一无菌的150ml摇瓶中，继续于30°C，220rpm培养72小时，并且每24小时加入150ul甲醇维持诱导。
[0035]诱导结束后，离心取上清进行SDS-PAGE检测。
[0036]实施例4
[0037]漆酶在染料降解中的方面的应用。
[0038]使用可见光分光光度计，通过记录单位时间内染料在最大吸收波长处的OD值变化计算脱色率(％):A0-A/A0X100% ,其中，AO为染料的初始吸收OD值，A为染料的终止吸收OD值。
[0039]选取偶氮类染料ARl (30mg/L)、RB5 (50mg/L)、，反应体系为3mL，包括0.5mL漆酶酶液(6U/mL)、1.0mL合成染料、1.5mL的20mmol/L，pH3.0的磷酸-柠檬酸缓冲液。在常温下反应2h，进行最大吸收波长下的OD值测量，根据公式计算脱色率，结果如下表1所示。
[0040]表1:漆酶lcc4对染料的脱色能力
[0041]
【权利要求】
1.一种茄镰刀菌漆酶lcc4，其特征在于相关蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，该茄镰刀菌漆酶对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.权利要求1所述茄镰刀菌漆酶基因的克隆方法，其特征在于包括下述步骤:I)以木质素为唯一碳源培养茄镰刀菌菌株，然后回收菌体，提取其总RNA并反转录得到cDNA ；2)对所得cDNA进行扩增得到茄镰刀菌菌株的漆酶基因部分序列进行测序。
3.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于所用引物序列为
Lac-Fl: CAAGGGAACGACCATGCAYTDBCAYGG ；
Fus-Rl:CCACTTCGAAGTGCCAATCTANRTGRCARTGdIA。
4.权利要求1所述茄镰刀菌漆酶基因的重组表达方法，其特征在于采用毕赤酵母作为载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达方法，其特征在于包括下述步骤:I)使用EcoR1、Not I限制两端带有酶切位点的镰刀菌漆酶基因以及PPIC9K，胶回收产物，T4连接酶连接，转化到E.coli ToplO，鉴定转化子，取阳性克隆进行测序；2)将质粒DNA(克隆至pPIC9K的重组子)，用Sac I线性化质粒，沉淀并回收DNA ；3)取毕赤酵母感受态细胞和线性化的质粒DNA混合均匀后电转化，电转化器完成后加入预冷的山梨醇溶液，将液体涂布MD平板，培养至白色的菌落长出；4)影印转化子至含有抗生素的YEH)平板培养，挑取长势良好的菌落到普通YEH)平板上培养将其接种至BMGY液体培养基；5)培养后离心收集菌体，用BMMY液体培养基重悬菌体，将菌液放入另一无菌摇瓶中继续培养并加入甲醇维持诱导。
【文档编号】C12N15/81GK104073475SQ201410271201
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】赵辛, 吴兆韡, 司玮 申请人:西北农林科技大学